طويلة الأمد في فيفو تتبع ديناميات الخلايا التحريضية داخل الخوادر المورفولوجية

من خلال استغلال إمكانات التصوير طويلة المدى لنموذج العذراء الجديد هذا جنبا إلى جنب مع ذبابة الفاكهة ، يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات التئام الجروح والمناعة الفطرية. توفر مرحلة العذراء بعض المزايا المميزة للتصوير الحي مقارنة بنماذج التئام الجروح ذبابة الفاكهة التقليدية. على سبيل المثال ، يمكن تصوير الشرانق على مدى فترات زمنية أطول بكثير ، وتتوفر مساحة أكبر من الأنسجة للتلاعب التجريبي ، ويوجد المزيد من الخلايا الدموية في هذه المرحلة.

بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين كفاءة تعطيل الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي بشكل كبير خلال مراحل العذراء هذه ، مما يسمح بإسقاط العديد من الجينات بطريقة محددة في الأنسجة أو الوقت. لإنشاء مجموعة الشرانق ، قم بإعداد قوارير مع 20 أنثى عذراء و 20 ذكرا. ثم قبل 18 ساعة من جلسة التصوير ، اجمع ما لا يقل عن 10 شرانق بيضاء حديثة التكوين من القوارير.

لجمع خادرة ، استخدم ملقطا أو فرشاة طلاء دقيقة لإخراجها من سطح القارورة الداخلية ونقلها بعناية إلى جانب قارورة ذبابة جديدة. بعد أن تتطور الشرانق إلى النقطة الزمنية المطلوبة ، انقلها إلى قطعة من الشريط اللاصق على الوجهين مثبتة على شريحة زجاجية. الآن ، تحت مجهر تشريح المجال الساطع ، قم بإزالة الشرانق بعناية من أغلفتها.

ضع الشرانق بحيث تكون جوانبها البطنية ملتصقة بإحكام بالشريط. قم بعمل الشق الأول في المنطقة الأمامية من الشرانق باستخدام الملقط. تأكد من أن حالة العذراء في هذه المنطقة مجوفة وخالية من أنسجة العذراء لأن الشرانق ستتقلص داخل الحالة أثناء تطور العذراء المبكر.

بعد ذلك ، قم بتمزيق أو قطع علبة العذراء بعناية في اتجاه أمامي إلى خلفي باستخدام ملقط أو مقص دقيق حتى تصبح الخادرة خالية تماما من الغلاف البني غير الشفاف. كن حذرا ، هذه الشرانق هشة للغاية. من الأهمية بمكان الآن ألا يثقب الملقط والمقص الدقيق سطح العذراء خلال هذه الخطوة.

حاول تجنب لمس الخادرة نفسها أثناء إزالة العلبة المحيطة. الآن قم بتركيب الشرانق غير التالفة في طبق زجاجي القاع باستخدام غراء السباعي. قم أولا بإيداع خط من غراء الهبتان المحضر من 10 ميكرولتر.

ثم بعد خمس ثوان من التجفيف ، استخدم الملقط لنقل الشرانق التي تم تشريحها بعناية إلى الغراء. عند التعلم ، اصطف ما يصل إلى خمس شرانق. يمكن تحضير المزيد من خلال الخبرة المكتسبة.

قم بلف الشرانق باستخدام ملقط لتركيب الشرانق بحيث يكون الجناح مسطحا على زجاج الغطاء مع اتصال غالبية سطح الجناح بشكل مباشر بزجاج الغطاء. أخيرا ، لمنع الجفاف ، أضف قطعة من ورق الترشيح الماص المنقوع في الماء المقطر إلى جانب الطبق السفلي الزجاجي. ثم قم بتغطية الطبق واستمر في إجراء الجرح الناجم عن الليزر.

انقل الشرانق المثبتة إلى مجهر ميداني واسع مزود بنظام استئصال بالليزر قابل للضبط. قم بضبط ليزر الاستئصال النبضي بالأشعة فوق البنفسجية المبرد بالهواء بالنيتروجين إلى الطول الموجي المطلوب باستخدام خلية الصبغة المناسبة. للحصول على الجرح الأمثل ، اضبط معدل تكرار النبض على 40 هرتز.

الآن باستخدام 40 مرة أو 63 مرة الأهداف والحقل الساطع ، اضبط عناصر التحكم في مرحلة المجهر لتحديد موقع جناح العذراء لأول خادرة يتم إصابتها. ركز على مستوى ظهارة جناح العذراء الأقرب إلى زلة الغطاء الزجاجي. قم بمحاذاة المنطقة المراد إصابتها مع المنطقة المستهدفة المعروفة من ليزر الاستئصال.

للقيام بذلك ، استفد من علامة التصويب داخل عدسة المجهر. بعد ذلك ، اضبط قوة الليزر عن طريق ضبط شريحة مخفف كثافة الطاقة في المجهر. استفد من نقاط توقف النقر لجعل الإعداد قابلا للتكرار.

الآن لعمل جرح ، قم بتنشيط ليزر الاستئصال بنقرة سريعة على التحكم اليدوي. ثم تحقق من ظهور فقاعة الهواء العابرة في موقع الاستئصال وهو أمر طبيعي مع الجرح. إذا لم ينجح الجرح ، فحاول تغيير المستوى البؤري.

بدلا من ذلك ، قم بزيادة طاقة الليزر تدريجيا باستخدام شريحة المخفف حتى يتم تحقيق أحجام الجرح المطلوبة. بعد جرح هوامش جناح العذراء ، انقل الطبق ذو القاع الزجاجي بسرعة إلى مجهر مناسب لتصوير الفاصل الزمني. ثم افتح برنامج التقاط الصور المناسب.

في البرنامج ، قم بتشغيل الليزر المناسب واضبط قوتها وكسبها / إزاحة للحصول على إشارة فلورية كافية دون تشبع البكسل. بشكل عام ، تعمل أقل طاقة ليزر ممكنة في النطاق من خمسة إلى 20٪ بشكل أفضل لتقليل التبييض الضوئي. ركز على جناح العذراء بالكامل تحت تكبير منخفض أو ركز على الجرح تحت تكبير عال للتحقيق في إصلاح الجرح.

لالتقاط كل من الظهارة المصلحة وتجنيد الخلايا الالتهابية ، اضبط المجهر أولا على تسجيل مكدس z باستخدام ضبط التركيز الدقيق على لوحة التحكم. امسح من الظهارة المصابة إلى الفضاء خارج الخلية تحتها التي تحتوي على خلايا دموية مهاجرة. بعد ذلك ، اضبط البرنامج لتسجيل شرائح z من خلال جناح العذراء كل ثلاثة ميكرونات أو على فترات أضيق.

بالنسبة للتصوير بفاصل زمني، سجل z-stacks كل 30 ثانية على الأقل لمدة ساعة واحدة على الأقل. عند استخدام مجسات الصور القابلة للتحويل لتحويل الصور بشكل انتقائي وتسمية مجموعة فرعية من الخلايا أثناء التصوير ، افتح الوحدات المناسبة داخل برنامج التصوير لإجراء تحويل الصورة وتنشيط الليزر 405 نانومتر. ثم حدد الخلايا المراد تحويلها إلى الصور داخل برنامج FRAP باستخدام أداة التحديد.

بعد ذلك ، قم بتعيين المسار الزمني لتحويل الصور إلى إطار تكرار واحد واضبط الليزر 405 نانومتر على 20٪ طاقة الليزر. ثم انقر فوق بدء التجربة لإجراء تحويل الصور. بمجرد الانتهاء ، اخرج من وحدة FRAP وعد إلى شاشة التصوير الأصلية.

هناك قم بضبط الليزر على الفلوروفورات المستخدمة وتصوير الخلايا المحولة بالصور وغير المحولة بالصور باستخدام تسجيلات الفاصل الزمني. تم تصوير الأجنحة المصابة لذبابة الفاكهة الشرانق بعد 18 ساعة من تكوين الشرانق باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني متحد البؤر. حفزت الإصابة الناجمة عن الليزر في ظهارة جناح العذراء الهجرة السريعة للخلايا المناعية الفطرية ذبابة الفاكهة التي تسمى الخلايا الدموية إلى موقع الجرح.

تم تصنيف الخلايا الدموية بكل من علامة نووية وعلامة سيتوبلازمية أو هيكلية خلوية للسماح بالتتبع وعرض مورفولوجيتها ، على التوالي. يوضح تتبع المسارات النووية للخلايا الدموية الديناميكيات المكانية والزمانية المعقدة للاستجابة الالتهابية. في غضون 30 دقيقة من جرح الخلايا الدموية الموجودة بالقرب من موقع الإصابة بدأت في الهجرة الموجهة نحو الجرح.

في النهاية ، تبدأ الخلايا الدموية الموجودة تدريجيا بعيدا عن الإصابة في الهجرة نحو الجرح. من خلال استخدام الصور الفلوروفور القابلة للتحويل ، تم تصنيف مجموعات سكانية فرعية من هذه الخلايا الدموية ذات الأجنحة المهاجرة بشكل انتقائي. تم استخدام هذه الطريقة لإظهار أن الخلايا الدموية المجندة في الجرح الأولي يتم إزالة حساسيتها مؤقتا للجرح الثاني الذي تم إنشاؤه بعد 90 دقيقة.

من خلال تسمية E-cadherin داخل تقاطعات الالتصاق الخلوية مع GFP ، يمكن التعرف بسهولة على حافة الجرح وهذا يسمح بتحليل ديناميكيات التئام الجروح. تبدأ معظم الجروح في إعادة الظهارة في غضون ساعة من الإصابة. تتقدم حافة الجرح إلى الداخل وتلتئم الجروح في النهاية في غضون ثلاث ساعات.

بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن تحضير العديد من الشرانق للتصوير المباشر في غضون 10 دقائق فقط ، ولكن أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه بمجرد تشريح ذبابة الفاكهة من حالة العذراء ، تكون شرانق ذبابة الفاكهة معرضة للغاية للتلف والجفاف. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة الفطرية للتعاون مع علماء الأحياء الحاسوبية وتطبيق نمذجة رياضية أكثر تعقيدا لاستكشاف سلوك إشارات جاذب الجرح المسؤولة عن تجنيد الخلايا الالتهابية. وحتى في الآونة الأخيرة ، تم تصنيف أنواع الخلايا البديلة أيضا لمتابعة استجابتها للإصابة التي يسببها الليزر وقد كشف هذا أن خلايا الخلايا الشحمية ، ذبابة الفاكهة خلايا الجسم الدهنية ، تستجيب أيضا للجروح داخل هذا النظام.