نموذج الفئران من إزالة المزيل القشرية الدماغية على نطاق واسع الناجمة عن الحقن داخل الدماغ من السيتوكينات الموالية للالتهابات

الهدف العام لهذا الإجراء هو توليد إزالة البيلين على نطاق واسع من قشرة نصفي الكرة الدماغي في نموذج الفئران باستخدام التحصين دون السريري ضد المايلين oligodendrocyte glycoprotein، تليها حقن الدماغ الفائدة من السيتوكينات من خلال القسطرة المزروعة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أمراض إزالة الميالين الالتهابية في الدماغ، مثل التصلب المتعدد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تولد التهاب تسبب إزالة البيلين المادة الرمادية في قشرة نصفي الكرة الدماغي دون أن يؤدي إلى المقابس المادة البيضاء.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو فهم أفضل لآليات إزالة المايلين القشرية التي لوحظت في الغالب في الأنواع التدريجية من التصلب المتعدد. لبدء هذا الإجراء، قم بتجميع القسطرة وغطاء القسطرة بالمدخل. بعد ذلك، قطع القسطرة إلى طول ملليمترين مع مشرط.

ثم حلق رأس فأر مخدر بين الأذنين باستخدام ماكينة الحلاقة الكهربائية. ضع الجرذ في الإطار المجسم وأمن رأسه باستخدام قضبان الأذن ولوحة العض. تأكد من أن الرأس أفقي وتحقق من استقراره عن طريق الضغط عليه بإصبع أو ملقط.

بعد ذلك، ضعي قطرات العين التشحيمية لمنع جفاف القرنية أثناء الجراحة، وغطي العينين بمادة مبهمة لمنع أي تعرض جراحي للضوء. بعد ذلك ، قم بتنظيف منطقة الحلاقة بالتناوب تطبيق 70٪ الإيثانول و 10 ٪ povidone اليود المعقدة. لزرع القسطرة، قم بعمل شق طولي بطول حوالي سنتيمترين على طول خط الوسط.

ثم استخدم المشابك بلدغ لعقد الجلد على الجانبين. إزالة الدم باستخدام قضيب طرف القطن. بعد ذلك، قم بإزالة البيريوستوم، وتنظيف الأنسجة باستخدام قضيب طرف القطن، وفضح الجمجمة والسماح لها بالجفاف لمدة دقيقة واحدة تقريبا.

بعد ذلك ، حدد المعالم التشريحية ، لامبدا ، البريغما والخياطة الوسيطة. مع الحفر المثبتة على الإطار المجسمة، ضع طرف بت الحفر في bregma كنقطة انطلاق. نقل اثنين ملليمتر الخلفي من bregma، و 2.4 ملليمتر أفقيا إلى خياطة وسيطة.

ثم حفر ثقب قطره 0.5 ملليمتر للقسطرة في هذا الموضع. حفر ثلاثة ثقوب أخرى من قطر 1.3 ملليمتر مسامير مرساة بضعة ملليمترات بعيدا عن الحفرة الأولى. إزالة غبار العظام عن طريق الري مع حوالي 1-2 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم وتنظيف الجمجمة.

في وقت لاحق، تشديد مسامير مرساة من قبل اثنين إلى ثلاثة يتحول الكامل. أدخل قسطرة بطول ملليمترين عبر الثقب الأول عموديا على سطح الجمجمة. في حين لا يزال عقد القسطرة، وتطبيق القليل من الاسمنت الأسنان والسماح لها بلمرة مع التعرض لفترة وجيزة لضوء علاج الأسنان من أجل تحقيق الاستقرار في القسطرة.

ثم تطبيق المزيد من الاسمنت الأسنان حول القسطرة، مرساة مسامير، وترسيخ الاسمنت الأسنان مع ضوء علاج الأسنان لمدة 15 إلى 30 ثانية، تأكد من أن تصلب الاسمنت. بعد الزرع، أغلق الجلد بخيوط قابلة للتكسير الأمامي، والخلفي للقسطرة. ثم حقن خليط الترياق تحت الجلد.

بعد ذلك، إدارة 2.5٪ enrofloxacin عن طريق الحقن تحت الجلد للعلاج بالمضادات الحيوية الوقائية. أعد الحيوان إلى القفص المعدل وأبقه تحت الملاحظة لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات مع تطبيق ضوء الأشعة تحت الحمراء لتجنب انخفاض حرارة الجسم. كرر علاج enrofloxacin وإدارة carprofen في مليغرام واحد لكل ملليلتر تحت الجلد لتخفيف الألم عن طريق الحقن في اليوم التالي للجراحة.

لإعداد خليط التحصين، قم بتوصيل اثنين من المحاقن الزجاجية ذات الحافة السفلية ذات القفل 10 ملليلتر بأذرع قصيرة من stopcock ثلاثي الاتجاه، وإغلاق المنفذ الثالث بالذراع الطويلة. بعد ذلك، ماصة ملليلتر واحد من IFA و 50 ميكروغرام من rMOG معا. وضبط الخليط إلى حجم النهائي من اثنين من ملليلتر مع برنامج تلفزيوني عقيمة.

ضع خليط IFA و rMOG المخفف في المحقنة المفتوحة ، ثم أدخل المكبس برفق مع الحفاظ على ضغط فضفاض على المكبس المقابل. استحلاب inoculum عن طريق قيادتها من حقنة واحدة إلى أخرى عن طريق دفع المكابس ذهابا وإيابا حتى يكون أبيض ولزج. بعد ذلك ، قم بإصلاح حقنة قفل أقل ملليلتر واحدة إلى الذراع القصيرة المفتوحة للتوقف الثلاثي وملئها ب inoculum.

توزيع جميع الحقن inoculum إلى واحد ملليلتر والاحتفاظ بها على الجليد حتى الحقن. في وقت لاحق، حقن 200 ميكرولتر من خليط IFA و rMOG تحت الجلد في قاعدة الذيل تحت تخدير isoflurane مؤقت باستخدام إبرة قياس 21. لحقن السيتوكين داخل المخ، ضبط طول قنية الموصل إلى ملليمترين.

ملء حقنة ملليلتر واحد مع خليط السيتوكين. ثم قم بتوصيل المحقنة بقنية الموصل. بعد ذلك، ملء القنية مع خليط السيتوكين، وتجنب خلق أي فقاعات.

ثم، قم بتركيب المحاقن على مضخة الحقن القابلة للبرمجة وبرمجتها لحقن بمعدل 0.2 ميكرولتر في الدقيقة. بدء تشغيل المضخة والحفاظ على العمل من أجل تجنب تشكيل فقاعة الهواء في غيض من القنية. بعد ذلك، قم بإزالة غطاء القسطرة بالمدخل.

أدخل قنية الموصل في القسطرة، ثم قم بشدها وشدها. ثم السماح للحقن للمضي قدما لمدة 10 دقائق قبل وقف المضخة. اترك القنية داخل القسطرة لمدة 20 دقيقة للسماح للحجم المحقون بالانشراء الكامل.

في وقت لاحق، فك قنية موصل وإزالتها ببطء لتجنب تأثير فراغ. إعادة ربط غطاء القسطرة مع مدخل والمسمار عليه. السماح للحيوان للتعافي من التخدير في قفص.

يمكن تقييم إزالة المايلين القشرية في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن السيتوكين عن طريق الكيمياء الهستولوجية المناعية ل PLP. الشكل 6A يظهر سليمة PLP النشاط المناعي في اليوم 15 في التحكم المحصنة moggy التي تلقت برنامج تلفزيوني عقيم فقط من خلال القسطرة المزروعة. في اليوم الأول بعد حقن السيتوكين ، يمكن بالفعل اكتشاف إزالة المايلين في MOG الرئيسية.

وإن كان، فقط في المنطقة القريبة من منطقة القسطرة. يبقى النشاط المناعي PLP سليما في القشرة الكونترالاتية بعد يوم واحد من حقن السيتوكين. في اليوم الثالث ، يمكن ملاحظة زيادة تدريجية في فقدان التفاعل المناعي ل PLP ، والذي ينتشر في قشرة ipsilateral.

يمكن أيضا اكتشاف إزالة المزيل القشرية الكونترالاتية في اليوم الثالث ، ولكنها تقتصر إلى حد ما على المنطقة الواقعة تحت مسامير المرساة. بين الأيام من 9 إلى 15، يؤثر إزالة المايلين على أجزاء كبيرة من قشرة نصفي الكرة الأرضية. يتم الحفاظ على إزالة الميالين القشرية لمدة تصل إلى 30 يوما بعد حقن السيتوكين في نصفي الكرة الأرضية مع إعادة ايلين جزئيا فقط.

الشكل 6J يظهر كمية من فقدان PLP في المادة الرمادية القشرية بعد حقن السيتوكين داخل المخ. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد إزالة الميالين من المادة الرمادية باستخدام التحصين تحت السريري ضد بروتينات المايلين، تليها الحقن داخل الدماغ من السيتوكينات من خلال القسطرة المزروعة. هذا النموذج الحيواني يمكن أن تساعد الباحثين في دراسة أنواع التدريجي من التصلب المتعدد، طبقة رمادية المادة إزالة الميالين هو علامة كاملة.

القسطرة المزروعة تمكن جولات متعددة من إزالة الميالين أو التسليم بين الخلايا من الأدوية العلاجية المحتملة التي تخضع لتحقيق ما قبل السريرية دون التسبب في صدمة الناجمة عن الحقن.