إدارة خارجية من المجاميع المرتبطة ميكروسوميس ألفا-سينوكلين إلى الخلايا العصبية الأولية كنموذج خلية قوية لتشكيل ييفات

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ألفا سينوكلين ، مثل توضيح آلية انتشار التجميع وسمية ألفا سينوكلين في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب تنقية ألياف ألفا سينوكلين مسبقة التشكيل تستغرق وقتا طويلا. ستظهر الإجراء لوسيا روتا ، طالبة الدراسات العليا من مختبر COLA.

لبدء الإجراء ، قم بإعداد مخزن التجانس واحتفظ به على الجليد. بعد ذلك ، قم بتجانس الأنسجة الطازجة أو المجمدة في حجم واحد إلى 10 من محلول التجانس المثلج البارد باستخدام معادلة مدقة تفلون مع 10 إلى 15 ضربة. بعد ذلك ، انقل كل المتجانس الأولي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ، وجهاز الطرد المركزي عند 1 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية من أجل إزالة النوى والخلايا غير المنقطعة في الحبيبات الناتجة.

بعد ذلك ، تجاهل الحبيبات النتيجة. بعد ذلك ، قم بنقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق ، وقم بتشغيله عند 10،000 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد من أجل الحصول على المادة الطافية الثانية والحبيبات. ثم انقل هذا المادة الطافية إلى زجاجة من البولي كربونات ، وقم بطردها عند 100 ، 000 مرة G لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي فائق ودوار بزاوية ثابتة.

أعد تعليق الحبيبات الخام P100 مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجانس. انقل الحبيبات الخام P100 إلى أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق ، وجهاز الطرد المركزي عند 10 ، 000 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد. بعد 20 دقيقة ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق P100 مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجانس.

بعد ذلك ، صوتنة العينة لمدة ثانيتين على الجليد ، وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لأداء Western Blot ، قم بإلقاء هلام تدرج أربعة إلى 20٪ ثلاثي جلايسين بولي أكريلاميد على جهاز الرحلان الكهربائي العمودي. قم بإذابة ميكروغرام واحد من كسور ألفا سينوكلين المرتبطة بالميكروسومات في المخزن المؤقت للعينة المتناسقة ، وقم بتحميله على الجل.

في بئر مختلف ، قم بتحميل خمسة ميكرولترات من علامة البروتين القياسية. قم بتشغيل الجل بجهد 100 فولت في مخزن مؤقت يعمل ب tris-glycine SDS حتى تصل علامة البروتين إلى نهاية الجل. بعد ذلك ، انقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز باستخدام مخزن كربونات أساسي.

احتفظ بالعينة طوال الليل في الغرفة الباردة بطاقة ثابتة عند 200 مللي أمبير. في اليوم التالي ، قم بسد الغشاء باستخدام PBS-T مع 5٪ من الحليب الجاف الخالي من الدسم على شاكر مداري لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اشطف الغشاء لفترة وجيزة باستخدام PBS-T.

احتضان الغشاء مع SIN-1 عند واحد إلى 5 ، 000 ، أو الجسم المضاد ألفا سينوكلين P-Ser129 عند واحد إلى 5 ، 000 في 2.5٪ حليب جاف خالي الدسم في PBS-T بين عشية وضحاها في الغرفة الباردة أو الثلاجة عند أربع درجات مئوية على شاكر مداري. في اليوم التالي ، اغسل الغشاء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام PBS-T على شاكر مداري. احتضان الغشاء بجسم مضاد ثانوي مضاد للفئران أو مضاد للأرانب HRP عند واحد إلى 3 ، 000 في 2.5٪ حليب جاف خالي الدسم في PBS-T لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري.

بعد ذلك ، اغسل الغشاء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام PBS-T على شاكر مداري لمدة ثلاث مرات. احصل على الإشارة من خلال مجموعة التلألؤ الكيميائي العادية. لعلاج الخلايا العصبية ، اسحب مجاميع ألفا سينوكلين المرتبطة بالميكروسومات التي تم الحصول عليها من الحبل الشوكي لثلاثة فئران معدلة وراثيا مريضة مختلفة من أجل الحصول على محلول ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر مخفف بمخزن التجانس الأصلي.

بعد ذلك ، قم بإزالة ثلث الوسط ، واستبدله برفق بوسط الخلايا العصبية الجديدة. أضف ميكروغراما واحدا من مجاميع ألفا المرتبطة بالميكروسومات المجمعة إلى وسط الخلية. أعد الخلايا العصبية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.

أضف ثلث الوسط الطازج إلى العينة دون استبدال الوسط مرة كل ثلاثة أيام لمدة أسبوع واحد. بعد أسبوع واحد من العلاج ، قم بإزالة ثلث الوسط ، واستبدله برفق بوسط جديد يحتوي على 2٪ B27 ، و 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين ، واثنين من الجلوتامين. كرر كل ثلاثة أيام لمدة أسبوع قبل تثبيت الخلايا.

لأداء التألق المناعي ، في غطاء الدخان الكيميائي ، قم بإصلاح الخلايا العصبية بنسبة 2٪ بارافورمالدهيد و PBS في محلول سكروز بنسبة 5٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون اهتزاز. بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة محلول التثبيت ، واغسل الخلايا العصبية لفترة وجيزة باستخدام PBS ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم باختراق الخلايا العصبية بنسبة 0.3٪ من التوتر السطحي غير الأيوني في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم اغسل الخلايا العصبية لفترة وجيزة باستخدام PBS ثلاث مرات. احتضان الخلايا العصبية بنسبة 3٪ FBS و PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري لمنع مواقع الارتباط غير المحددة. بعد ذلك ، احتضان الخلايا العصبية بجسم مضاد أولي مناسب مذاب في 3٪ FBS و PBS طوال الليل في الغرفة الباردة أو الثلاجة طوال الليل عند أربع درجات مئوية على شاكر مداري.

في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة ، واغسل الخلايا لفترة وجيزة باستخدام PBS لمدة ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم باحتضان الخلايا العصبية بالجسم المضاد الثانوي الفلوري المناسب المذاب في 3٪ FBS و PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام على شاكر مداري. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة ، واغسله لفترة وجيزة باستخدام PBS لمدة ثلاث مرات.

بعد ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا العصبية بمحلول DAPI لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام على شاكر مداري. بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة ، واغسله لفترة وجيزة باستخدام PBS لمدة ثلاث مرات. قم بتركيب أغطية الغطاء على الشريحة باستخدام وسيط تركيب مضاد للبهتان.

في هذه الدراسة ، يؤدي إعطاء ميكروغرام واحد من مجاميع ألفا سينوكلين المرتبطة بالميكروسومات المجمعة من الفئران المعدلة وراثيا A53T المريضة إلى وسط ثقافة الخلايا العصبية القشرية أو الحصينية إلى تكوين يعتمد على الوقت لشوائب ألفا سينوكلين ، وهو إيجابي للأجسام المضادة ألفا سينوكلين الخاصة بالمجموع. بعد يومين من العلاج ، تظهر هذه الركام على شكل نقاط صغيرة متناثرة ستصبح أكثر وفرة في نقاط زمنية لاحقة. بعد أسبوعين ، تشبه شوائب ألفا سينوكلين الهياكل الطويلة والناضجة الشبيهة بالخرز المنتشرة بشكل كبير في جميع أنحاء الثقافات العصبية باتباع نمط العصبية وتتموضع جزئيا مع علامات ما قبل المشبكي والعصبية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ضبط نسبة ميكروغرام من مجاميع ألفا سينوكلين المرتبطة بالميكروسوم إلى كثافة الخلايا العصبية المطلية وعزل مجاميع ألفا سينوكلين المرتبطة بالميكروسوم من الأنسجة الغنية بشوائب ألفا سينوكلين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية مجاميع ألفا سينوكلين المرتبطة بالميكروسوم من الفئران المعدلة وراثيا المريضة ، لاستخدامها كعلاج للخلايا العصبية الأولية للحث على تكوين شوائب ألفا سينوكلين.