الإنتاج والتصور جدارها البكتيرية وبروتوبلاستس لتميز التعريب الببتيد مضادات الميكروبات

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الببتيد المضاد للميكروبات حول ما إذا كانت الببتيدات تتموضع أو تعبر عبر غشاء الخلية. يسمح استخدام البلاستيدات الكروية والبلاستيات البروتوبلاستية بتصور وتحليل توطين الببتيد في نظام نموذجي ذي صلة من الناحية الفسيولوجية دون تحديات الدقة التي تواجهها تصوير الخلايا البكتيرية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للببتيدات المضادة للميكروبات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على العوامل النشطة الأخرى للأغشية مثل الببتيدات المخترقة للخلايا.

يجب تحضير البلاستيدات الكروية الإشريكية القولونية سالبة الجرام والبروتوبلاست B.megaterium موجب الجرام في خزانة أمان بيولوجية أو غطاء تدفق رقائقي باستخدام تقنية معقمة مناسبة. إذا رغبت في ذلك ، يمكن أن تحتوي السلالات البكتيرية على بلازميد مقاوم للمضادات الحيوية ، ويمكن تحضير البلاستيدات الكروية والبروتوبلاستات على مقعد مختبر مفتوح. في هذا الفيديو ، يتم تحضير البلاستيدات الكروية والبروتوبلاستات على مقعد مختبر مفتوح باستخدام سلالات بكتيرية مقاومة للمضادات الحيوية.

لإنشاء مزرعة ليلية ، استخدم طرف ماصة دقيقة معقمة لنقل مستعمرة بكتيرية واحدة من صفيحة زراعة أجار صلبة إلى أنبوب استزراع سعة 14 مليلترا ، يحتوي على ملليلترتين إلى ثلاثة ملليلترات من مرق الصويا التريبتيكاز ، TSB ، لمدة 16 إلى 21 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الرج. لتحضير بكتريا قولونية سالبة الجرام ، قم بتخفيف المزرعة الليلية بنسبة واحدة إلى 100 ، و 25 مليلتر من TSB في قارورة 250 مليلتر ، وأعد البكتيريا إلى حاضنة الاهتزاز لمدة 2.5 ساعة أخرى. عندما يصل المحلول إلى كثافة ضوئية من 0.5 إلى 0.8 عند 600 نانومتر ، قم بتخفيف المزرعة بنسبة واحد إلى عشرة في TSB الطازج في قارورة جديدة سعة 250 مليلتر لحضانة ثانية لمدة 2.5 ساعة مع تركيز فعال نهائي يبلغ 60 ميكروغرام لكل مليلتر من السيفاليكسين.

لإنتاج خيوط خلية واحدة يبلغ طولها حوالي 50 إلى 150 ميكرومتر ، كما هو موضح تحت المجهر الضوئي بتكبير 1000x. الطرد المركزي المحلول البكتيري لحصاد الخيوط وصب المادة الطافية. اغسل الخيوط بإضافة لطيفة من مليلتر واحد من 0.8 سكروز مولار ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات.

بعد دقيقة واحدة ، تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات ، وأضف الكواشف المشار إليها بترتيبها إلى الخيوط. بعد عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أضف تدريجيا ملليلترا واحدا من المحلول أ على مدى دقيقة واحدة ، مع تحريك المحلول برفق يدويا. احتضان المحلول لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم قسم تعليق الفتيل إلى قسمين متساويين بين أنبوبين مخروطيين سعة 15 مليلتر يحتويان على سبعة ملليلتر من محلول أربع درجات مئوية ب. بعد ذلك ، قم بتكسير الخيوط عن طريق الطرد المركزي ، واستخدم الماصة اللاصقة لإزالة جميع المواد الطافية بعناية باستثناء واحد إلى ملليلتر دون إزعاج الكريات.

استخدم ماصة دقيقة p1000 لإعادة تعليق الكريات برفق. تحقق من أجزاء صغيرة من العينة بحثا عن تكوين البلاستيدات الكروية بواسطة الفحص المجهري الضوئي. يمكن بعد ذلك تخزين البلاستيدات الكروية عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أسبوع أو حتى تمر بثلاث دورات ذوبان التجميد.

لتحضير البروتوبلاست B.megaterium موجب الجرام ، قم بتخفيف الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها بنسبة واحد إلى 1000 في 100 مل من ثلاثة بالمائة TSB في قارورة 250 مليلتر لمدة 4.5 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الرج. عندما تصل المزرعة السائلة إلى كثافة بصرية من 0.9 إلى 1.0 عند 600 نانومتر ، قم بتقسيم البكتيريا بين أنبوبين مخروطيين سعة 50 مليلتر للطرد المركزي ، واستخدم الماصة العصبية لإزالة المواد الطافية أعد تعليق الكريات في 2.5 مل من وسط البروتوبلاست لكل أنبوب ، واسحب التعليق في أنبوب مخروطي واحد للزراعة في قارورة سعة 125 ملليلتر.

أضف ملليلتر واحد من خمسة ملليغرام لكل مليلتر من الليزوزيم إلى المزرعة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية مع الرج. مراقبة نمو البروتوبلاست تحت المجهر الضوئي وملاحظة أي مخالفات ، مثل البكتيريا التي تظهر على شكل قضبان منتفخة بدلا من الكرات. في نهاية الحضانة ، انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر للطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط البروتوبلاست.

يمكن بعد ذلك تخزين البروتوبلاست عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أسبوع أو حتى يمر بثلاث دورات ذوبان في التجميد. لتصور الكروبلاست أو البروتوبلاست ، انقل خمسة ميكرولترات من تعليق الاهتمام إلى شريحة زجاجية مطلية ب Poly L Lysine ، متبوعة باثنين من الميكرولتر من fitc المسمى 100 إلى 200 ميكرومولار من الببتيد المضاد للميكروبات أو AMP. بعد حضانة لمدة ثلاث دقائق محمية من الضوء ، أضف ميكرولتر واحدا من غشاء مناسب إلى العينة لمدة ثلاث دقائق أخرى في الظلام.

في نهاية الحضانة ، قم بتغطية البلاستة الكروية أو البروتوبلاست المسمى بزلة غطاء زجاجي ، وأغلق زلة الغطاء بطلاء الأظافر. لتصوير الخلايا ، قم بتشغيل المجهر متحد البؤر والليزر المناسب وحدد هدف 63x ، ثم استخدم برنامج التصوير المناسب للحصول على ثماني صور مكدس Z مركب 512 × 512 تتكون من شرائح 0.5 ميكرومتر من كل خلية بكتيرية ذات أهمية. لتصور توطين AMP المسمى فلورية ، افتح صور مكدس Z المركبة في برنامج تحليل تصوير مناسب وحدد موقع الجزء المركزي من أول كروبيلاست أو بروتوبلاست محل أهمية.

ضع منطقة دائرية واحدة بقطر 0.3 ميكرومتر على الغشاء ، وواحدة في وسط الخلية ، وواحدة بعيدا عن الخلية لقياس مضان الخلفية ، مع الحرص على تجنب وحدات البكسل المشبعة. يمكن بعد ذلك حساب متوسط شدة التألق في كل منطقة ذات أهمية بواسطة البرنامج. تجعل حدود دقة المجاهر الضوئية التقليدية من الصعب التمييز بين ما إذا كانت إشارات الببتيد المصنفة فلورسنت تنشأ من الغشاء أو الفضاء داخل الخلايا في البكتيريا العادية.

عندما تتداخل الإشارات إلى الغشاء ، سيبدو أنها تتداخل مع الفضاء داخل الخلايا. في المقابل ، يؤدي الحجم المتضخم للكروبلاست والبروتوبلاست مقارنة بالبكتيريا الطبيعية إلى دقة واضحة بين علامة الغشاء والفضاء داخل الخلايا. مما يسهل التمييز بين توطين الببتيد.

على سبيل المثال ، يمكن تصور التوطين في الغشاء والانتقال عبر غشاء الخلية للببتيد المسمى بالفلورسنت في كل من بكتريا قولونية كروبلاست و B.megaterium protoplast ، عن طريق الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر كما هو موضح للتو. يسمح وضع المناطق ذات الأهمية على الغشاء والفضاء داخل الخلايا للبلاستيدات الكروية أو البروتوبلاست وفي الخلفية ، بحساب نسبة شدة مضان الببتيد داخل الخلايا إلى شدة مضان الببتيد على غشاء كل كروي أو بروتوبلاست يتفاعل مع AMP. على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتصور تفاعلات طفرة الببتيد الميكروبي المشتق من الهيستون مع بكتريا قولونية spheroplast و B.megaterium protoplasts.

في هذه التجربة ، أظهر AMP نمط توطين مماثل في كلتا السلالتين من البكتيريا. تسليط الضوء على تقليل الانتقال بالنسبة للببتيد من النوع البري. في النهاية ، تمكن هذه التقنية الباحثين من استكشاف أنماط توطين الببتيد على مستوى خلية واحدة.

تقديم رؤى حول آلية عمل الببتيد محل الاهتمام. بالإضافة إلى السماح للباحثين بجمع أعداد أكبر من الصور للتوصيف المنهجي لآليات الببتيد ، فإن صور البلاستيدات الكروية الأكبر حجما والبروتوبلاستات أكثر قابلية للإدارة للتحليل الكمي من تلك الموجودة في الخلايا البكتيرية الأصغر.