بروتوكول سهلة لتركيب تجميع الذاتي القائم على بولياميني الببتيد أمفيفيليس (نظام) والحيوية ذات الصلة

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية تزيين البرمائيات الببتيد بالبوليامينات واستخدام مجموعات الحماية المثمنة الأضلاع الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك توليد برمائية ببتيد هجينة مع كتل بناء كيميائية غير محمية تحتوي على جوانب تفاعلية متعددة. سيظهر الإجراء مهدي وناتاليا وكريشنيا ، طلاب المختبرات من مختبر كوندا شيريدان. أولا ، قم بوزن راتنج كلوريد 2-Chlorotrityl بعناية ، ضع الراتنج في وعاء توليف متوسط المسامية بسعة 50 مل.

بعد ذلك ، قم بتثبيت وعاء التوليف على شاكر ميكانيكي متغير السرعة وقم بتدوير الوعاء بزاوية 45 درجة لزيادة التحريض. ثم أضف 15 مل من DCM إلى الراتنج. بعد السماح لحبات الراتنج بالانتفاخ لمدة 15 دقيقة ، أضف ثمانية مكافئات من مادة البوليامين المطلوبة إلى الراتنج ، واتركها تتفاعل لمدة خمس ساعات.

بعد خمس ساعات ، قم بإجراء اختبار كايزر لتأكيد تفاعل ناجح للبولي أمين على الراتنج. بعد ذلك ، قم بحماية مجموعة الأمين الأولية عن طريق إضافة أربعة مكافئات من DDE في الميثانول اللامائي وهز خليط التفاعل بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإجراء اختبار كايزر لتأكيد الحماية الناجحة من خلال عدم وجود اللون الأزرق من حبة الراتنج.

بعد ذلك ، قم بتصريف DCM وغسل الراتنج مرتين بمزيج من اثنين إلى واحد من DCM و DMF. الآن ، أضف 20 مكافئا من أنهيدريد Boc في DCM إلى الراتنج واسمح للتفاعل بالاستمرار لمدة ثلاث ساعات. بعد إجراء اختبار الكلورانيل لتأكيد حماية الأمين الثانوي ، قم بتصريف خليط المذيبات وغسل الراتنج مرتين بمزيج من DCM و DMF.

بعد ذلك ، أضف 10 مل من محلول 2٪ من الهيدرازين في DMF إلى الراتنج. بعد الاهتزاز لمدة ساعة واحدة ، قم بإجراء اختبار القيصر لتأكيد إزالة الحماية الناجحة للأمين الأساسي. بعد ذلك ، امزج أربعة مكافئات من الأحماض الأمينية المحمية Fmoc ، و 3.95 مكافئ من HBTU ، و 15 ما يعادل DIPEA.

أضف خليطا واحدا إلى واحد من DCM و DMF وقم بصوتنة الكوكتيل حتى الذوبان الكامل. تأكد من خلط الأحماض الأمينية وعامل الاقتران و DIPEA وتنشيطه حقا قبل إضافة الخليط إلى الراتنج. بعد الانتظار من ثلاث إلى خمس دقائق لضمان تنشيط حمض الكربوكسيل ، أضف خليط التفاعل إلى الوعاء الذي يحتوي على الراتنج واترك التفاعل يستمر لمدة ساعتين إلى أربع ساعات في درجة الحرارة المحيطة.

قم بإجراء اختبار القيصر أو الكلورانيل في كل خطوة لتأكيد الاقتران الناجح. بعد إجراء اختبار kaiser لتأكيد الاقتران الناجح ، قم بإلغاء حماية مجموعة Fmoc من الأحماض الأمينية عن طريق إضافة 10 ملليلتر من محلول 20٪ من 4-ميثيل بيريدين في DMF. بمجرد الانتهاء من التفاعل ، قم بإجراء اختبار كايزر لتأكيد إزالة الحماية الناجحة من الأحماض الأمينية.

بعد ذلك ، اغسل الراتنج مرتين باستخدام 10 مل من DMF كل غسلة تدوم لمدة 5 دقائق ، وأخيرا ب 10 مل من DCM لمدة 10 دقائق. بعد اقتران جميع الأحماض الأمينية المطلوبة ، اقتران الذيل الكارهة للماء بآخر حمض أميني عن طريق إضافة 10 مكافئات لوظيفة حمض الكربوكسيل المطلوبة إلى 9.5 مكافئ من HBTU ، و 12 مكافئا ل DIPEA. قم بتسخين الكوكتيل حتى الذوبان الكامل ، ثم أضف الكوكتيل إلى الوعاء.

قم بإجراء التفاعل لمدة خمس ساعات على الأقل ، على الرغم من أنه من المستحسن إجراؤه طوال الليل للحصول على أعلى عائد. اغسل الراتنج بثمانية ملليلتر من DMF لمدة دقيقتين ، ومرتين بثمانية ملليلتر من DCM لمدة خمس دقائق. قبل كل إضافة ، قم بتصريف المذيب من الوعاء.

بمجرد إجراء الغسيل الأخير ، جفف الراتنج تحت الفراغ لمدة 15 دقيقة. لتحضير 15 مل من كوكتيل الانقسام ، أضف 14 مل من TFA إلى 0.5 مل من الماء ، و 0.5 مل من Triisopropylsilane. أضف كوكتيل الانقسام هذا إلى الراتنج ، ورجه لمدة ساعتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.

بعد اكتمال تفاعل الانقسام ، اجمع المحلول في قارورة سفلية مستديرة سعة 50 ملليلترا. بعد ذلك ، قم بتركيز TFA في الفراغ إلى واحد إلى ملليلتر باستخدام مبخر دوار عند ضغط منخفض ، مع تسخين الخليط عند 40 درجة مئوية بعد التبخر ، أضف محلول TFA الذي تم الحصول عليه ، بالتنقيط ، إلى قارورة قاعية مستديرة تحتوي على 15 مل من الأثير البارد اللامائي لترسيب PPA. بعد ذلك ، أضف 5 مل من الأثير البارد اللامائي إلى القارورة الأصلية التي تحتوي على محلول TFA المركز.

سونيكات لاستعادة المواد الصلبة الإضافية. ثم ، ادمج مع حل الأثير من الخطوة السابقة. غطي القارورة وضعيها داخل الثلاجة طوال الليل لزيادة هطول الأمطار.

في اليوم التالي ، اجمع المواد المترسبة عن طريق الترشيح الفراغي باستخدام قمع مرشح قرص مركزي ناعم أو متوسط الحجم. أخيرا ، اغسل الراسب مرتين بخمسة إلى عشرة ملليلتر من الأثير البارد لإزالة أي مواد عضوية متبقية. يؤكد تتبع HPLC و MALDI Spectrum وجود منتج PPA الذي يجب أن يكون نقاوته أكبر من 95٪ لتوصيف المواد أو التقييم البيولوجي.

لوحظت ذروة حادة واحدة في تتبع HPLC القائم على الأشعة فوق البنفسجية ويتوافق طيف MALDI مع الوزن الجزيئي المحسوب ل PPA داخل زائد أو ناقص دالتون واحد. يمكن تصور التجميع الذاتي ل PPAs وتحليله عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال ، والفحص المجهري للقوة الذرية ، وتشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة ، والفحص المجهري الإلكتروني الماسح ، وتشتت الضوء الديناميكي. سيؤدي التجميع الذاتي الناجح إلى هياكل نانوية محددة جيدا ، في كل من المجهر الإلكتروني للإرسال والفحص المجهري للقوة الذرية.

بمجرد إتقانه ، يمكن إجراء هذا البروتوكول في غضون ثلاثة أيام إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، تذكر تنقية المنتجات وتقييم نقائها قبل أي دراسات لاحقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تحضير جزيئات أخرى ، مثل البرمائية الببتيدة والببتيدات والهجينة الببتيد والبوليامين.

بعد تطويرها ، تساعد هذه التقنية البحث في مجال دمائيات الببتيد ذاتية التجميع لاستكشاف تأثير هياكل نانو البوليامين في مجالات مثل توصيل الأدوية أو التصوير أو التحفيز بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حمل تخليق البرمائيات الببتيدية القائمة على البولي أمين وبرمائيات الببتيد ذات الصلة. يمكن أن يكون حمض ثلاثي فلورو أسيتيك و 4-ميثيل بيريدين خطيرين ، ويجب اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعاطف المختبر والعمل في غطاء الدخان أثناء تنفيذ هذا الإجراء.