الارتداد الكيميائية للخلايا الجذعية Pluripotent البشرية التقليدية إلى حالة شبيهة بالسذاجة مع التمايز مولتيلينيجي تحسين فاعلية
يونيو 10, 2018
نقدم بروتوكول للكفاءة والسائبة والسريع الارتداد الكيميائية الخلايا الجذعية pluripotent البشرية التقليدية أعدادا النسب (هبسك) إلى دولة برييمبلانتيشن مثل epiblast pluripotent السذاجة ابيجينوميكالي مستقرة. نتائج هذا الأسلوب في التعبير الجيني انخفاض النسب أعدادا وتحسن ملحوظ في تمايز مولتيلينيجي الموجهة عبر مرجع واسع النطاق من خطوط هبسك التقليدية.
تعيد طريقة LIF-3i الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية التقليدية إلى حالة بدائية أكثر مع ميزات بيوكيميائية ونقلية وراثية وفوق الجينية للجنين البشري قبل الزرع. تعمل هذه الطريقة على تحسين وظيفة الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية التقليدية عن طريق تقليل التعبير عن الجينات الموجهة للأنساب ومسح الاختلافات بين السلالات الموجهة للتمايز الملاحظ بشكل شائع بين خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية المستقلة. باستخدام هذه الطريقة، تحافظ الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية المعاد تكوينها كيميائيًا على الاستقرار النووي والفوق النووي بعد تمرير ممتد، بما في ذلك في المواقع المطبوعة ويمكن تمايزها مباشرةً بكفاءة محسنة دون الحاجة إلى خطوة إعادة تهيئة.
ستفتح طريقة LIF-3i طرقًا جديدة للتحقيق في علم الأحياء التطوري البشري المبكر وقد تتقدم الطب التجديدي من خلال تحسين تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية، وتوجيه الجينات، وتوليد الخيميراات بين الأنواع. لبدء البروتوكول، قم بصيانة وتوسيع الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية التقليدية أو الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hPSCs) مع الأنماط النووية العادية المصادق عليها في ثقافات مشتركة مع الخلايا الليفية الجنينية الفأرية أو نظام زراعة الخلايا المغذية القائم على MEF أو في نظام زراعة خالٍ من الخلايا المغذية. قم بتحضير الخلايا المغذية MEF في طبق سداسي الفتحات مُجهز مسبقًا بالجيلاتين قبل يوم واحد على الأقل من تمرير ثقافات الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية التقليدية التي تم تكييفها مع LIF-5i.
بعد أن تصل ثقافات الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية التقليدية إلى حوالي 50٪ من الكثافة، استبدل وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية القياسي بمليمترين لكل بئر من وسط عامل تثبيط سرطان الدم 5i أو LIF-5i. قم بزراعة وصيانة الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية التقليدية والخلايا الليفية الجنينية لمدة تصل إلى يومين في LIF-5i في حاضنة CO2. قم بتغيير وسط LIF-5i يوميًا لتكييفها لتمريرها اللاحق والعودة المستقرة في LIF-3i.
بالنسبة للثقافات التقليدية الخالية من الخلايا المغذية، قم بزراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية في LIF-5i فقط بين عشية وضحاها قبل تمريرها في الصباح التالي. قبل التمرير، قم بغسل الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية التقليدية التي تم تكييفها مع LIF-5i مرة واحدة بـ PBS وأضف ملليمترًا واحدًا من عامل تفكيك الخلايا إلى كل بئر. ثم قم بحضانة الطبق لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2.
بعد الحضانة، قم بتحريك الخلايا بلطف مع ماصة في تعليق خلايا مفردة. قم بجمع تعليق الخلايا في وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في تخفيف ضعفين على الأقل في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر وقم بتحريك الخلايا بلطف عن طريق الأنبوبة للحصول على تعليق خلايا مفردة. قم بفصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي بقوة 300 جم لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي، قم بشفط وتجاهل المحلول الفوقاني وإعادة تعليق اللقمة الخلوية في واحد إلى اثنين من المللترات من وسط LIF-5i. ثم قم بعدد الخلايا. قم بغسل الطبق MEF المسطح المسبق بـ PBS مرتين بـ 2 ملليلتر من PBS لكل بئر.
وزّع مرة أو مرتين 10 إلى 6 خلايا في 2 ملليلترات من وسط LIF-5i في بئر واحد من طبق MEF المغسول بـ PBS. ضع الطبق في حاضنة CO2. في اليوم التالي، قم بهز الطبق بلطف لرفع جميع الخلايا غير المرفقة وشفط الوسط واستبدل الوسط بمليمترين من وسط LIF-5i.
كرر هذه الخطوة يوميًا لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام أو حتى تصل الخلايا إلى 60 إلى 70٪ من الكثافة. يدعم هذا البروتوكول إعادة التحويل البدائية السريعة والجماعية لمجموعة كبيرة من خطوط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة طالما يتم استبعاد المستحضرات البشرية للخلايا الجذعية متعددة القدرات مع التمايز الملحوظ أو الأنماط النووية غير الطبيعية بدقة. بعد التكييف الأولي مع LIF-5i، قم بتمرير ثقافات LIF-3i المستقرة اللاحقة كل ثلاثة إلى أربعة أيام في خزانة السلامة البيولوجية أو عندما تصبح الثقافات 60 إلى 70٪ من الكثافة.
قم بشفط وسط الزراعة واغسل كل بئر من ثقافات LIF-5i-LIF-3i بإضافة 2 ملليلتر من PBS بلطف. تجاهل PBS وأضف ملليمترًا واحدًا من محلول تفكيك الخلايا. قم بحضانة الخلايا لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2.
بعد الحضانة، قم بجمع تعليق الخلايا، وأضف وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية غير المعالج في تخفيف ضعفين، وقم بتحريك الخلايا بلطف عن طريق الأنبوبة للحصول على تعليق خلايا مفردة. قم بنقل التعليق إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر. قم بفصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي بقوة 300 جم لمدة خمس دقائق وقم بشفط وتجاهل المحلول الفوقاني.
قم بإعادة تعليق اللقمة في وسط LIF-3i، ثم قم بعدد الخلايا. ثم قم بزرع مرتين 10 إلى 5 خلايا لكل بئر على MEF المشع في الطبق السداسي الفتحات المجهزة بالجيلاتين لتمرير روتيني لثقافات LIF-3i. بالنسبة للثقافات التي تم تكييفها مبدئيًا مع LIF-5i، قم بوضع كثافة أعلى مبدئيًا قبل التمرير الأول إلى LIF-3i MEF.
قم بتمرير N-hPSC لمدة أربع إلى سبع تمريرات جماعية مستمرة في وسط LIF-3i قبل استخدام N-hPSC في الدراسات الوظيفية أو الحفظ بالتبريد. قم بتسجيل عدد تمريرات N-hPSC في الوسط التقليدي أو وسط LIF-3i. اكتشفت اللطخات المناعية الفلورية ولطخات ويسترن التعبير عن الأشكال المنشطة والمفسفرية الإجمالية لـ STAT3 و Erk1/2، وهي العلامات الرئيسية للتعددية الجزيئية.
كشفت اللطخات بالهيماتوكسيلين واليوزين لشرائح الورم الأرومي عن تمايز قوي في جميع الطبقات الجرثومية الثلاث مع أنسجة خارجية ومتوسطة ونهائئية هيكلية جيدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة التحويل الجماعي الفعال للخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية التقليدية إلى حالة بدائية باستخدام طريقة LIF-5i العالمية التسلسلية إلى LIF-3i الكيميائية. قبل محاولة هذا البروتوكول، من المهم البدء بتمرير منخفض لخطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية التقليدية التي تتوافق مع الأنماط النووية العادية.
يجب أن تكون ثقافات الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية التقليدية غير متمايزة في الغالب وتحتوي على عدد قليل من الخلايا المتمايزة تلقائيًا قبل البدء. تعمل خطوة التكييف الأولية والقصيرة مع LIF-5i بشكل كبير على تعزيز التوسع المستعمري للخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية التقليدية وتسمح لها بالعودة لاحقًا إلى البدائية بمفردها باستخدام LIF-3i بكميات جماعية، وبالتالي تجنب الحاجة إلى اختيار أو استنساخ مستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية البدائية النادرة لاحقًا. سيسهل التحسين الإضافي لهذه الطريقة الكيميائية التي تستخدم مثبطات التانكيراس في ظروف زراعة متوافقة مع GMP خالية من الخلايا المغذية وترشيد الجيل الفعال، سريريًا، لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا الوظيفية والقابلة
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تعمل طريقة LIF-3i بكفاءة على إرجاع الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات التقليدية (hPSCs) إلى حالة شبيهة بأرومة الجنين في مرحلة ما قبل الانغراس البدائية. ويعزز هذا البروتوكول قدرات التمايز ويقلل من تعبير الجينات المجهزة للسلالات الخلوية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- الطب التجديدي
- البيولوجيا التطورية
خلفية علمية
- تظهر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) التقليدية تباينًا في التمايز.
- تعد حالات تعدد القدرات الساذجة (Naïve pluripotent states) ضرورية لفهم التطور المبكر.
- هناك حاجة إلى طرق تمايز محسنة للتطبيقات التجديدية.
- تعالج طريقة LIF-3i هذه التحديات.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لإعادة الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hPSCs) إلى الحالة الساذجة.
- تعزيز كفاءة التمايز الموجه.
- تقليل التباين بين الخطوط الخلوية في خطوط hPSC.
الطرق المستخدمة
- الاستزراع المشترك مع الخلايا الليفية الجنينية للفئران (MEFs).
- أنظمة الاستزراع الخالية من الخلايا المغذية.
- تحضير أطباق ستية الآبار المجلتنة للخلايا المغذية من نوع MEF.
- التمرير الممتد للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) المرتدة لتقييم الاستقرار.
النتائج الرئيسية
- إعادة تحويل ناجحة للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى حالة بدائية مستقرة.
- ملاحظة انخفاض في تعبير الجينات المجهزة للتمايز السلالي.
- تحسين كفاءات التمايز دون الحاجة إلى إعادة التجهيز.
- الحفاظ على الاستقرار الكروموسومي والاستقرار فوق الجيني.
الاستنتاجات
- تفتح طريقة LIF-3i آفاقاً جديدة في بيولوجيا النمو البشري.
- وقد تساهم في تطوير تطبيقات الطب التجديدي.
- يمكن لهذا البروتوكول أن يسهل عمليات استهداف الجينات والدراسات الخيمرية.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول عكس حالة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات التقليدية بكميات كبيرة إلى حالة شبيهة بالحالة البدائية (naive-like state)، مما يقلل من التباين بين الخطوط الخلوية في نتائج التمايز ويحسن القدرة الوظيفية على تعدد القدرات. ومن خلال تعزيز كفاءة التمايز دون الحاجة إلى إعادة التهيئة، يدعم هذا البروتوكول نمذجة قبل سريرية أكثر قابلية للتنبؤ ويقلل من المخاطر المرتبطة بالتحقق من الأهداف في مسارات الطب التجديدي. كما أن قابلية تكرار هذه الطريقة عبر خطوط متنوعة من hESC وhiPSC الخالية من الجينات المنقولة تسهل تدفقات عمل قياسية وقابلة للتوسع لأبحاث الاكتشاف المبكر والأبحاث الترجمية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية عن طريق إعادة ضبط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) المجهزة سلالياً إلى حالة تنموية أبكر مع تقليل الضجيج فوق الجيني.
- القيمة التشغيلية: تمكين التحقق الوظيفي من الأهداف باستخدام مقارنات متماثلة جينياً بين الحالات الشبيهة بالساذجة والحالات المجهزة لتوضيح آلية العمل.
- القيمة التنبؤية: تعزيز الثقة في فحوصات التمايز من خلال تقليل التباين بين السلالات الذي يؤدي إلى إرباك عملية تحديد المركبات الرائدة.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: ينتج خلايا جذعية متعددة القدرات بشرية (hPSCs) شبيهة بالخلايا الساذجة، وتكون مستقرة وطبيعية من الناحية النمطية النووية، مما يجعلها مناسبة لمنصات الفحص عالية الإنتاجية التي تتطلب استجابات خلوية متسقة.
- المخرجات الكمية: يدعم كفاءات تمايز قابلة للقياس عبر الطبقات الجرثومية، مما يتيح إجراء فحص قوي للعلاقة بين الجرعة والاستجابة والفحص المظهري.
- القابلية للتوسع: يسمح بالارتداد الجماعي دون الحاجة إلى اختيار نسيلة، مما يدعم تحضير المقايسات واسعة النطاق وحملات فحص الكواشف.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الصلة بالمرض: يوفر نظاماً بشرياً شبيهاً بـ epiblast في مرحلة ما قبل الانغراس يتسم بالدقة التطورية لنمذجة اضطرابات النمو المبكر.
- الاستمرارية الترجمية: يحافظ على الاستقرار الإبيجينومي في المواقع المطبوعة، مما يدعم الاستقراء الموثوق للتمايز في الجسم الحي وتكوين المسخ (teratoma).
- تقليل المخاطر الآلية: يمحو التباين بين الخطوط الخلوية في التمايز الموجه، مما يقلل من السلبيات/الإيجابيات الكاذبة في دراسات الفعالية قبل السريرية.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تدمج الطريقة التسلسلية من LIF-5i إلى LIF-3i في سير عمل الاكتشاف من خلال تمكين توليد حالة بدائية موحدة قبل اختبارات التمايز، ومراحل تحديد المركبات الرائدة، والتحقق من الصلاحية قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات عبر المقارنات المتجانسة جينياً بين حالات hPSC الشبيهة بالحالة الساذجة مقابل الحالات المجهزة لتوضيح آليات الأهداف والاعتماديات المسارية.
- الفحص: توفر مجموعات خلوية قابلة للتكرار وكفؤة في التمايز لتوحيد المقايسات وفحص المركبات مع تقليل التباين بين الآبار.
- التحليلات: تتيح قراءات كمية لكفاءة التمايز ثلاثي السلالات وتطبيع التعبير الجيني للمقارنات بين الظروف المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تحافظ على الاستقرار الإبيجينومي والنواة الصبغية عبر الممرات الممتدة، مما يدعم الدراسات قبل السريرية الطولية ومحاذاة المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: تؤسس طريقة عكسية وغير مرتبطة بمنصة معينة لتوليد hPSCs شبيهة بالحالة الساذجة عبر مشاريع وخطوط خلوية متعددة، مما يقلل من عمليات التحسين المكررة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في نتائج التمايز من خلال تقليل إشارات التحفيز السلالي وتعزيز استقرار تعدد القدرات.
- القيمة التشغيلية: بروتوكول موحد، متوافق مع الخلايا المغذية أو خالٍ منها، يتميز بأدنى حد من التدخل وقابلية عالية للتكرار عبر المختبرات المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تقليل الضوضاء البيولوجية في اختبارات التمايز، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: يتيح تحديد الأولويات لخطوط الخلايا بناءً على قدرة إعادة الضبط الوظيفي بدلاً من التباين في الخلفية الجينية، مع مراعاة المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الجذعية، بما في ذلك تمرير الخلايا، والتفكيك، والتحقق من مؤشرات تعدد القدرات.
- يعتمد على حاضنة CO2، وخزانة السلامة البيولوجية، ومعدات زراعة الخلايا القياسية للزراعة المشتركة مع خلايا MEF أو التكيف الخالي من الخلايا المغذية.
- يستلزم تركيبة وسط قياسية تشمل LIF، ومثبطات GSK3β و MEK/ERK، ومثبط التانكيريز XAV939 لبروتوكول LIF-3i، مع إمكانية إضافة forskolin و purmorphamine للتكيف مع بروتوكول LIF-5i.
- يتطلب التحقق من النمط النووي الطبيعي وانخفاض التمايز التلقائي في خطوط hPSC الأولية لضمان نجاح عملية الارتداد.
- قد يتطلب التكيف عبر الأنظمة النموذجية تحسيناً لكثافة الزرع الأولية ومدة التعرض لـ LIF-5i من أجل التوسع النسلي.
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Title
1:14
Bulk Stabilization of Conventional hPSC Cultures for Subsequent Naïve Reversion with a Brief LIF-5i Adaptation
4:38
Long-term Maintenance and Expansion of N-hPSC in LIF-3i Medium
7:14
Results: Effective Reversion of Human Pluripotent Stem Cells
7:47
Conclusion
