عزل وتحليل المجتمعات الميكروبية في التربة، رهيزوسفيري، وجذور في تجارب الأعشاب المعمرة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ميكروبيوم التربة والجذور وجذور الغلاف الداخلي للجذور ، مثل كيفية تغير تنوع المجتمع الميكروبي استجابة لنوع العينة والعلاج والنمط الجيني للنبات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مناسبة تماما للتجارب الميدانية التي تتطلب أعدادا كبيرة من العينات والنسخ المتماثل. سأعرض الإجراء أنا وستيفاني فوتريل ، طالبة دراسات عليا وفني أبحاث من مختبري.

لبدء البروتوكول ، قم بتسمية صينية الغسيل والدلو بملاحظة لاصقة بتفاصيل عينة النبات. احمل الدلو الملصق على قطعة الأرض واترك وعاء الغسيل في محطة العمل المحددة في الحقل. اختر واجمع نباتين بشكل عشوائي لكل قطعة أرض من مناطق مختلفة داخل قطعة الأرض.

بعد ذلك ، اخترق التربة بمجرفة على عمق 30 سم لقطع أي من الجذور الجانبية التي تحمل النبات في التربة. احفر جذور النبات عن طريق الاستفادة من المجرفة وضع كرة الجذر في الدلو المسمى. أعد الجرافة إلى محطة العمل في الميدان.

هز الجذور واستخدم الأشياء بأسمائها الحقيقية أو الحارث المحمول لإزالة التربة من الجذور. ارتد القفازات وضع الجذور بالقرب من محطة المعالجة. بعد هز الجذور ، اخلطي التربة في وعاء الغسيل وقم بتفتيت أي كتل تربة باستخدام آلة حراثة محمولة.

ضع عينة من التربة الخالية من الحطام في كيس تخزين بسحاب مقاس 17.7 × 19.5 سم وضعه على الجليد. تعقيم مقص التقليم في 70٪ إيثانول. استخدم المقص المعقم لاستئصال مجموعة متنوعة من الجذور ، ما يقرب من أربعة إلى ستة جذور لكل نبات ويبلغ طول كل جذر حوالي تسعة إلى 12 سم.

ضع الجذور المستقطعة في أنبوب 50 مليلتر يحتوي على 35 مل من عازلة الفوسفات المعقمة مع خافض للتوتر السطحي مثل Silwet L-77. هز الأنابيب لمدة دقيقتين لتحرير الجذور من سطح الجذور. تحسين الاهتزاز باستخدام مولد ودوامة.

مع ملقط معقم في 70٪ من الإيثانول ، قم بإزالة الجذور من الأنبوب ، وصمة عارها لفترة وجيزة على مناشف ورقية ، وضعها في أنبوب جديد سعة 50 مل. ضع كلا من الأنبوب الذي يحتوي على الجذور والأنبوب الذي يحتوي على جذور على الجليد. أضف ما يقرب من 35 مل من 50٪ مبيض بالإضافة إلى 0.01٪ توين 20 إلى أنابيب 50 مليلتر مع جذور مجمعة في الحقل.

دوامة أو رج الأنابيب لمدة 30 إلى 60 ثانية. اسكب المبيض ، وأضف 35 مل من 70٪ من الإيثانول ، ودوامة أو هز الجذور لمدة 30 إلى 60 ثانية أخرى. بعد الاهتزاز ، اسكب 70٪ من الإيثانول وأضف 35 مل من الماء المعقم عالي النقاء والدوامة أو رج العينة لمدة دقيقة واحدة.

كرر خطوة الشطف بالماء مرتين أخريين حتى يتلقى الجذر ما مجموعه ثلاث مرات شطف بماء معقم فائق النقاء. امسح الجذور على مناشف ورقية جافة ونظيفة واستخدم منشفة ورقية نظيفة لكل عينة. باستخدام ملقط معقم ومقص تقليم ، قم بتقطيع الجذور إلى قطع بحجم خمسة ملليمترات تقريبا وضع الجذور المقطوعة في أنبوب مخروطي نظيف ، مسمى ، سعة 15 ملم ، ثم قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تتم معالجتها مرة أخرى.

هز الأنابيب سعة 50 مليلتر التي تحتوي على عينات جذرية من الحقل لمدة 20 إلى 30 ثانية لإعادة تعليق العينة بأكملها. باستخدام مصفاة خلية شبكية معقمة سعة 100 ميكرون ، قم بتصفية العينة المعاد تعليقها في أنبوب جديد سعة 50 مل. ثم ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 3 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

اسكب على الفور وتخلص من المادة الطافية. ضع كريات الجذور في أنابيب سعة 50 ملليلتر على الجليد. بعد ذلك ، أضف 1.5 مل من محلول الفوسفات المعقم بدون خافض للتوتر السطحي إلى كريات الجذور وقم بدوامها لإعادة تعليق العينة.

ماصة السائل المعلق في أنبوب ميكرو فوج نظيف ، مصنف ، سعة ملليلتر. قم بتدوير الأنابيب عند 15،871 مرة جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. اسكب المادة الطافية على الفور واستنزف الأنابيب على مناشف ورقية نظيفة.

قم بتخزين الكريات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تتم معالجتها مرة أخرى. باستخدام ملعقة معدنية معقمة ، املأ أنبوبا نظيفا ومسمى سعة ملليلتر بحوالي ثلاثة جرامات من التربة لاستخراج الحمض النووي وتجنب أي قطع جذر صغيرة وحطام. اشطف الملعقة المعدنية بنسبة 70٪ من الإيثانول بين كل عينة.

قم بتخزين عينة التربة هذه عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. في مقلاة غسيل نظيفة ، أفرغ كيس التربة في مناخل مكدسة مع المنخل الأكبر أعلى المنخل الأصغر وقم بنخل التربة يدويا من خلال كلا المناخلين. استخدم فرشاة لتنظيف المناخل بعناية بين العينات.

ضع جانبا 100 إلى 125 جراما من التربة المنخلة في كيس بسحاب مقاس 17.7 × 19.5 سم لتحليل التربة والفيزيائيا والكيميائية والملمس في المستقبل. ضع أكياس التربة عند أربع درجات مئوية للتخزين قصير الأجل. بعد ذلك ، صب النيتروجين السائل في دورق بلاستيكي بملاعق نظيفة وفي هاون نظيف.

ضع الأنسجة المجمدة في الهاون وطحنها بالمدقة إلى مسحوق ناعم. أضف النيتروجين السائل باستمرار طوال فترة الطحن للحفاظ على العينات مجمدة. استخدم ملعقة لنقل الأنسجة الأرضية في أنبوب نظيف ومسمى سعة ملليلترين ثم قم بتخزين الأنسجة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

امسح منطقة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول و 1٪ مبيض منزلي. قم بإزالة عينات التربة من التخزين تحت الصفر 20 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج في دلو ثلج. قم بإزالة غطاء حصيرة الختم من لوح الاستخراج سعة 96 بئرا وضع الغطاء بين منديلتين ورقيتين للحفاظ على نظافته أثناء عدم الاستخدام.

قم بتغطية 12 عمودا من اللوحة بشرائط PCR لاصقة ذات 8 آبار لتجنب التلوث. العارمة معقمة ، حجم صغير وزن قمع على مقياس وتزن 200 إلى 250 ملليغرام من التربة. ارفع الشريط اللاصق بعناية لأعلى ، ضع عنق قمع الوزن المملوء في البئر المناسب ، وقم بتوجيه عينة التربة برفق إلى البئر المناسب.

استبدل الشريط اللاصق لتغطية البئر. كرر هذه العملية لكل بئر ، باستخدام قمع معقم جديد لكل عينة. استبدل غطاء حصيرة الختم على لوحة الاستخراج وقم بتخزين اللوحة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لاستخراج الحمض النووي.

قم بإزالة عينات الجذور من التخزين بدرجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابة الثلج في دلو ثلج. قم بإعداد لوحة استخراج الحمض النووي كما هو الحال في القسم السابق. ضع مسحا ورقيا نظيفا على مقياس ، ثم قم بوضع ملعقة معدنية معقمة على الميزان.

استخدم الملعقة لاستخراج بعض حبيبات الجذور بعناية من أنبوب العينة. تزن ما بين 200 و 250 ملليغرام من عينة الجذور. ارفع الشريط اللاصق بعناية للكشف عن البئر الأول من لوحة الاستخراج.

قم بزاوية الملعقة المملوءة في البئر واكشط مادة الجذور في البئر المناسب باستخدام عود أسنان معقم. اشطف الملعقة المعدنية بالماء متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول بين العينات. أخيرا ، كرر هذه العملية لكل بئر من اللوحة حتى تمتلئ اللوحة ، مع ترك بئر فارغة كعنصر تحكم فارغ للاستخراج.

في مجموعة البيانات التمثيلية هذه ، كانت هناك اختلافات كبيرة بين أنواع العينات ، ويبدو أن الجذور والتربة أكثر تشابها في تكوينهما من الجذر. يظهر المزيد من التحليل أن هناك أيضا اختلافات ذات دلالة إحصائية للغاية في تكوين المجتمع الميكروبي بين الجذور والتربة. يظهر تحليل تنوع ألفا أن المجتمعات الميكروبية في الغلاف الداخلي كانت أقل من المجتمعات في التربة والجذور.

كان الاختلاف الوحيد المهم في التنوع بين أنواع الحشائش هو بين عينات الغلاف الداخلي من bluestem الكبيرة و switchgrass. يسلط تحليل الوفرة النسبية الضوء على هيمنة البكتيريا البروتينية متبوعة بالبكتيريا الشعاعية في جميع أنواع العينات. تهيمن البكتيريا الحمضية والكلوروفليكسي على التربة والجذور ، في حين أن الجذور تحتوي على وفرة نسبية أكبر من الجراثيم.

تحليل PERMANOVA لجميع أنواع العينات اختلافا كبيرا في تكوين المجتمع الميكروبي بسبب الأنواع النباتية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ سلسلة من الخطوات لاستخدامها في دراسة ميكروبيوم التربة والغلاف الداخلي والجذور. نود أن نشكر نبراسكا EPSCoR وبرنامج البنية التحتية للأبحاث EPSCoR التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم على التمويل الجزئي لهذا الفيديو التعليمي.