وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

يمكن أن تساعد هذه التقنية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة. مثل، تحديد كيفية نسب أحادية فرعية، أو التعبير عن علامات مختلفة، يتم تغييرها في حالات المرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية، هي أن الخلايا قريبة من حالتها الأصلية، وأن يتم استخدام تعليمات واضحة وتبرير، لتوفير طريقة موحدة الغوا.

عموما، قد الأفراد الجدد لهذا الأسلوب النضال، لأن العديد من الأوراق لا تعطي تعليمات واضحة حول كيفية إجراء الغاء من الخلايا. ابدأ هذا البروتوكول مع جمع عينات الدم وتحديد عدد خلايا الدم البيضاء ، كما هو مفصل في بروتوكول النص. تخفيف الدم مع المالحة الفوسفات المخزنة، لضبط التركيز إلى ما يقرب من 5 ملايين خلية الدم البيضاء لكل ملليلتر.

إعداد مزيج ما يكفي من الماجستير لعدد من الأنابيب عن طريق الجمع بين الدم, المضادة CD14-V450, المضادة CD16-APC ومكافحة HLA-DR-PerCP. دوامة وماصات 51.9 ميكرولترات من مزيج في كل أنبوب. أضف PE المسمى الأجسام المضادة لعلامات M1 و M2 ، وكذلك علامات للخلايا التائية وخلايا B والعدلات والخلايا القاتلة الطبيعية إلى الأنابيب المقابلة لها.

دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية في الظلام. الآن، إضافة 250 ميكرولترات من دمج خلايا الدم الحمراء حل إصلاح خلايا الدم البيضاء، ودوامة على الفور الخليط، بلطف. احتضان الخليط دوامة لمدة 10 دقائق في الظلام، في أربع درجات مئوية.

بعد 10 دقائق، إضافة 250 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني وتدور أسفل الخلايا في 260g، لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة عظمى، وإعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولترات من 1٪ الفورمالديهايد. تخزين الخلايا في أربع درجات مئوية، محمية من الضوء حتى يتم إجراء التحليل.

يجب أن يتم عملية استئصال التدفق في غضون 48 ساعة من إعداد العينة. للبدء، تحقق من سجل تدفق مقياس cytometer لضمان أن موظفي المرفق قد أجرى فحوصات مراقبة الجودة. لإعداد تجربة تدفق cytometry ، انقر على تجربة جديدة ، تليها عينة جديدة وأنبوب جديد ، لإضافة أنابيب.

حدد مخططات ثنائية المتغيرات، من خلال النقر على الرمز، واستخدام القوائم المنسدلة، لتحديد معلمات الوصول. ضمان إدراج مؤامرة CD16/CD14 ومؤامرة عرض كاشف جنبا إلى جنب مع الوقت، لرصد عملية الاستحواذ. إدراج أنبوب وانقر فوق، والحصول على.

تحقق من إعدادات الجهد الصك، وضمان أن إشارات كاشف ليست خارج النطاق. مراقبة الخلايا التي تقع في بوابة أحادية من مؤامرة CD14/CD16. تعيين عتبة التسجيل إلى 5،000 الأحداث لبوابة monocyte الكلاسيكية، وانقر على سجل.

استمر في تسجيل البيانات الخاصة بلأنابيب المتبقية. بعد أن تم تسجيل البيانات لجميع الأنابيب، وتصدير البيانات تدفق كملفات fcs للتحليل. لإجراء عملية البوابات الأحادية، افتح الملفات في برنامج التحليل، وانقر نقرًا مزدوجًا فوق اسم الأنبوب، وحدد معلمات من القوائم المنسدلة لتصور الخلايا على منطقة مبعثرة إلى الأمام مقابل رسم ارتفاع التشتت إلى الأمام.

إنشاء بوابة استبعاد مزدوجة، من خلال النقر على رمز أداة بوابة المضلع، وإرفاق الخلايا. حدد الخلايا المُسورة بالنقر المزدوج على المنطقة المُسورة. في مربع العرض الجديد، اضبط معلمات القائمة المنسدلة لعرض الخلايا على منطقة التشتت الأمامية مقابل مخطط ناحية التشتت الجانبي.

انقر على أيقونة بوابة مستطيلة، وسخاء حدد السكان أحادية، استنادا إلى خصائص مبعثر إلى الأمام والجانب، لاستبعاد غالبية الخلايا الليمفاوية، والخلايا القاتلة الطبيعية والميقبة. حدد الخلايا المسور عليها ثم إعادة عرضها على رسم CD14/CD16، وتحديد المعلمات باستخدام القوائم المنسدلة. انقر على بوابة المضلع ، لتحديد monocytes على أساس خصائصها ، مقلوب ل الشكل.

إذا كان السكان غير التقليديين لا يختلفون عن الخلايا إلى يسارها ، فمن المرجح أن يكون التلوث وينبغي التحقيق. حدد الخلايا المُسورة، وقم بعرض الخلايا الأحادية على رسم CD/16 HLA-DR، باستخدام القوائم المنسدلة لتحديد المعلمات. انقر على بوابة المضلع لتحديد الخلايا الإيجابية HLA-DR، واستبعاد أي خلايا قاتلة طبيعية المتبقية والعدلات.

حدد الخلايا المسور وعرض الخلايا الإيجابية HLA-DR على رسم CD14/HLA-DR باستخدام القوائم المنسدلة لتحديد المعلمات. انقر على بوابة المضلع، وارسم بوابة لاستبعاد خلايا HLA-DR عالية/CD14 منخفضة B. حدد الخلايا المسور عليها واستخدم القوائم المنسدلة لعرضها على رسم CD16/CD14.

من خيارات المؤامرة، حدد مؤامرة حمار وحشي، والتي ستمكن بوابات فرعية monocyte أن يوجه، لتحديد نسب فرعية. الآن ، انقر على أيقونة بوابة مستطيلة ، وحدد monocytes الكلاسيكية عن طريق رسم بوابة مستطيلة تقريبية حول CD14 عالية / CD16 السكان monocyte الكلاسيكية منخفضة. تحت العرض، حدد، إظهار الوسيطات، لعرض شدة الفلور المتوسط للوسيطيات التقليدية.

ضبط البوابة بحيث يكون توزيع السكان متساويًا من الوسط على اليسار وعلى اليمين، ويشمل جميع الخلايا إلى اليسار. حدد السكان المتوسطين عن طريق رسم بوابة مستطيلة التي تشمل الخلايا إلى يمين البوابة الكلاسيكية. ضبط الجزء السفلي من البوابة لاستبعاد الخلايا غير الكلاسيكية، من خلال محاذاة البوابة مع الجزء السفلي من الدوائر متحدة المركز، التي هي تماما داخل بوابة أحادية الكلاسيكية.

بوابة المجموعة الفرعية غير الكلاسيكية، عن طريق رسم مربع مستطيلة إلى أسفل من الحافة السفلى من المجموعة الفرعية المتوسطة، واختيار جميع الخلايا إلى أسفل من السكان. تحت العرض، حدد، إظهار ترددات البوابة، لتحديد النسبة المئوية لكل مجموعة فرعية أحادية. وأخيراً، حدد الخلايا من كل مجموعة فرعية أحادية.

قم بتغيير معلمات القائمة المنسدلة لإنشاء مدرج تكراري لكل مجموعة فرعية أحادية، مع عرض كل علامة. ثم، حساب درجة التعبير، باستخدام الوسط المتوسط أو الهندسي، كما هو موضح في بروتوكول النص. يتم عرض السكان أحادية البوابات بنجاح هنا.

والنسب تتماشى مع تلك الموجودة في الأدب. تم حساب النسب لهذه العينة، على النحو، 88.1٪ الكلاسيكية، 4.33٪ وسيطة و 7.49٪ غير الكلاسيكية. من خلال تقييم الوضع النسبي للسكان الآخرين ، من الواضح أن الخلايا T والعدلات الموضحة هنا باللون الأزرق ، تتبع جيدًا خارج شكل أحادية ، مقلوب ، على مؤامرة CD16/CD14.

ومع ذلك، تداخلت الخلايا القاتلة الطبيعية وفئات الخلايا B، الموضحة هنا باللون الأزرق، مع السكان أحاديي الخلايا غير الكلاسيكية. خرائط الحرارة التي تؤكد أن أنواع الخلايا الملوثة قد أزيلت، وتظهر هنا. وقد تم بوابات الخلايا القاتلة الطبيعية من قبل الخطوة CD16 HLA-DR، في حين أن الخلايا B قد تم بوابات بها HLA-DR CD/14 الخطوة.

يظهر هنا تعبير علامات M1 و M2 باللون الأزرق، نسبة إلى عناصر التحكم الخاصة بها في النمط الأيزوتيبي باللون الأحمر. CD120b علامة M1، ويبين تحول واضح فوق عنصر التحكم isotype، لجميع المجموعات الفرعية أحادية. هذا هو الحال أيضا بالنسبة لD93 علامة M2، مع التعبير هو أعلى في الكلاسيكية، معتدلة على وسيطة ومنخفضة على غير الكلاسيكية.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن نضمن أن الخلايا الملوثة مسور بها، لأنها يمكن أن تسهم في التعبير الكمي. وبعد هذا الإجراء، يمكن فحص علامات أخرى. من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل، كيف يتغير تعبير علامة أحادية في المرض.

لا ننسى أن العمل مع الدم البشري والفورمالديهايد يمكن أن تكون خطرة، وذلك الاحتياطات مثل، معدات الحماية الشخصية، واستخدام غطاء محرك النار الحيوي، ينبغي دائما أن تتخذ عند تنفيذ هذا الإجراء.