عزل الشرايين الشبكية للدراسات فيزيولوجيا الخلية السابقين فيفو

ويصف هذه المخطوطة بروتوكولا مباشرة لعزل الشرايين من شبكية الفئران التي يمكن استخدامها في الكهربية، الكالسيوم التصوير والضغط ميوجرافي الدراسات.

فهم كيفية التحكم في تدفق الدم في شبكية العين هدفا مهما ، حيث كان تدفق الدم غير الطبيعي متورطا في تطور مجموعة متنوعة من أمراض الشبكية التي تهدد البصر ، مثل اعتلال الشبكية السكري والزرق وانسداد الأوردة الفرعية. تلعب الشرايين الشبكية دورا رئيسيا في تنظيم تدفق الدم في شبكية العين عن طريق توسيع وتضييق قطرها اللمعي ، بوساطة التغيرات في انقباض خلايا العضلات الملساء التي تحيط بهذه الأوعية. لذلك يتطلب فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تنظيم نضح الشبكية استعدادات يمكن من خلالها الوصول إلى خلايا العضلات الملساء الشريانية الشبكية ودراستها في ظروف قريبة من الفسيولوجية قدر الإمكان.

في هذا الفيديو ، نوضح بروتوكولا مباشرا لعزل الشرايين عن شبكية الفئران يمكن استخدامه في مشبك التصحيح وتصوير الكالسيوم ودراسات تصوير العضل بالضغط. على مدى السنوات القليلة الماضية ، تم استخدام هذا المستحضر لتوفير مزيد من الأفكار حول تنظيم انقباض العضلات الملساء الوعائية وتدفق الدم في شبكية العين في كل من الصحة والمرض. اصنع محلولا سعة لتر واحد من الكالسيوم منخفض الكالسيوم يحتوي على Hanks'or LCH ، كما هو موضح في جدول المواد.

قم بتجميع معدات العزل قبل جمع الأنسجة. يجب أن تكون ماصة باستور الزجاجية مصقولة بالنار لتنعيم الطرف، ولكن ليس تضييق الطرف. قم بقص ماصة بلاستيكية بفتحة تتراوح من خمسة إلى سبعة ملليمترات تقريبا.

ضع العينين على طبق التشريح ، مغمورة في محلول LCH. استخدم مجموعة واحدة من الملقط لتثبيت العين في الطبق عن طريق إمساك مرفقات العضلات المدارية أو العصب البصري. تأكد من أن نقطة التثبيت قريبة قدر الإمكان من الصلبة لتثبيت العين.

باستخدام الشفرة ، قم بقطع القرنية على طول أورا سيراتا ، وقم بإزالة العدسة بالضغط برفق على الصلبة باستخدام الملقط. المنطقة الدائرية الصغيرة التي نراها في الجزء الخلفي من العين في هذه الصورة هي العصب البصري. باستخدام الشفرة ، قم بقص قطعة العين إلى نصفين بشكل متماثل من خلال القرص البصري.

باستخدام ملقط مغلق ، قم بتنظيف شبكية العين برفق من نصفي عيني العين ، مع الحرص على إزالة أي ملحقات متبقية في القرص البصري. كرر العملية بالعين الثانية ، وانقل شبكية العين المقطوعة إلى أنبوب الاختبار باستخدام الماصة البلاستيكية وقطرة صغيرة من وسط LCH. باستخدام الماصة البلاستيكية ، املأ أنبوب الاختبار ب LCH إلى حوالي خمسة ملليلتر ، واترك شبكية العين تستقر في قاع الأنبوب.

اغسل الأنسجة ثلاث مرات تقريبا عن طريق إزالة ما يقرب من أربعة ملليلتر من المحلول من الأنبوب وإضافة LCH جديد باستخدام الماصة البلاستيكية. عند الضرورة ، يجب إزالة الأنسجة الدخيلة. اغسل الجزء الداخلي من ماصة باستور الزجاجية بطرف مصقول باستخدام LCH لمنع الأنسجة من الالتصاق بالماصة.

باستخدام نفس الماصة ، قم بإزالة ما يقرب من أربعة ملليلتر من المحلول من أنبوب الاختبار ، وأضف ما يقرب من ملليلترين من LCH الطازج. افصل شبكية العين برفق عن طريق سحب الأنسجة عبر طرف الماصة الزجاجية ببطء، وطرد المحتويات في أنبوب الاختبار. حاول ألا تدخل فقاعات في هذه المرحلة ، وكرر العملية حتى يتم تفكيك شبكية العين إلى حجم ما يقرب من ملليمترات إلى ثلاثة ملليمترات مربعة.

اغسل الماصة من الداخل بحوالي ملليلترين من LCH ، واطردها في أنبوب الاختبار. اترك المحتويات تستقر في القاع على مدار خمس إلى 10 دقائق. كرر عملية التخليص كما هو موضح سابقا بقوة أكبر قليلا حتى يصبح حجم قطع الأنسجة حوالي ملليمتر مربع واحد.

اسمح للأنسجة بالاستقرار ، وكرر ذلك مرة أخرى بقوة أكبر حتى تتجانس المحتويات تماما ولا تبقى أي قطع من شبكية العين. يجب أن يظهر المحلول في هذه المرحلة حليبي المظهر. ستنتج هذه التقنية ما يصل إلى ثمانية أجزاء شريانية لكل عزلة ، بطول يتراوح من 200 إلى 2 ، 500 ميكرومتر.

قنية أحد طرفي الشرايين مع انسداد الطرف الآخر بقياس تضيق الأوعية الناجم عن الضغط ، والمعروف أيضا باسم الاستجابة العضلية المنشأ. يتم إجراء تصوير عضل الضغط الشرياني على النحو التالي. يتم نقل حصة من تجانس الشبكية إلى غرفة تسجيل فسيولوجية مثبتة على مسرح المجهر المقلوب.

اترك المتجانس ليستقر في قاع الغرفة لمدة خمس دقائق على الأقل. قم بالمسح الضوئي بصريا عبر غرفة التسجيل لتحديد الشرايين التي يزيد طولها عن 200 ميكرومتر وامتلاك نهاية مفتوحة يمكن من خلالها تقسيم الوعاء. قم بتثبيت أحد طرفي الوعاء باستخدام ملقط دقيق وزلة صغيرة من سلك التنغستن موضوعة فوق الوعاء.

باستخدام الأطراف المتداخلة لسلك التنغستن ، قم بمناورة الوعاء ليعمل أفقيا عبر الحمام ، بحيث يكون الطرف المفتوح متماشيا مع قنية الضغط. قم ببث الغرفة بدون كالسيوم Hanks'at 37 درجة مئوية. يتم إجراء القنات باستخدام الماصات الزجاجية.

يتم وضع القنية في الطرف المفتوح للوعاء باستخدام معالج دقيق دقيق. يتم وضع الطرف بجوار الفتحة مباشرة ، كما تم تقييمه عن طريق ضبط مستوى التركيز على المجهر ، بحيث يكون كل من نهاية الوعاء وطرف القنية في بؤرة التركيز في نفس الوقت وتتقدم قنية الضغط إلى فتحة الوعاء. مطلوب ماصة مساعدة للمساعدة في عملية القنية وتستخدم لكبح الشريان برفق وتوجيه جدار الشريان فوق قنية الضغط في نفس الوقت الذي يتم فيه تقدم القنية إلى تجويف الوعاء.

يتطلب هذا الإجراء حركة متزامنة وخاضعة للرقابة لكل من المتلاعبين وممارسة مكثفة لتحقيق معدل نجاح مرتفع. بعد دقيقة واحدة من التسجيل عند صفر ملليمتر من الزئبق ، يزداد الضغط داخل اللمعة إلى 40 ملم من الزئبق ، ويجب أن يتمدد الوعاء بسرعة ، مما يؤكد نجاح القنب. تضيق الأوعية الناجم عن الضغط ، أي الاستجابة العضلية ، سوف يتطور لاحقا على مدى 15 دقيقة تقريبا.

يتيح تسجيل مشبك التصحيح من خلايا العضلات الملساء الوعائية في الشبكية التحقيق في التيارات الأيونية لغشاء البلازما التي تنظم الكالسيوم داخل الخلايا وبالتالي الانقباض الخلوي. يمكن التسجيل في الخلية الكاملة وحيدة القناة من خلايا العضلات الملساء الفردية التي لا تزال جزءا لا يتجزأ من الشرايين الأم على النحو التالي. يتم عزل شرايين الشبكية وتثبيتها في غرفة التسجيل مع زلات أسلاك التنغستن.

يجب هضم الصفيحة القاعدية بعيدا لتمكين تكوين ختم عالي المقاومة بين ماصة التصحيح وغشاء خلية العضلات الملساء الشريانية. يتم دمج الشرايين بسلسلة متسلسلة من محاليل الإنزيم عند 37 درجة مئوية ، مما يؤدي أيضا إلى الفصل الكهربائي للخلايا المجاورة ، كما هو موضح في الأسهم الموجودة على الصورة. يتم تقييم مستوى الهضم في البداية على الفصل البصري لطبقات البطانية والعضلات الملساء أثناء خطوة الكولاجيناز.

يتم إزالة أي خيوط متبقية من الصفيحة القاعدية و / أو العصبية المحيطية عن طريق كنس الأطراف المغلقة للملقط الناعم بعناية على طول سطح الوعاء. لتثبيت الرقعة، يتم وضع طرف ماصة التصحيح عموديا فوق الخلية ذات الأهمية ويتم خفضها تدريجيا باستخدام الحركة الدقيقة والبطيئة للمعالج الدقيق للتلامس مع غشاء العضلات الملساء الشرياني. يتم الحكم على ذلك من خلال حركة الخلية والتغيير في مقاومة الماصة ، والتي يتم قياسها باستخدام بروتوكول اختبار ختم الخلية في برنامج الاستحواذ.

عندما يتم إنزال الماصة على الخلية ، ستزداد مقاومة مانع التسرب خمسة أضعاف تقريبا. يتم تطبيق الضغط السلبي بشكل عابر على الجزء الخلفي من الماصة ، ويتم تشكيل جيجاسيل تدريجيا. يتطلب ذلك تطبيقات متكررة للضغط السلبي على مدار دقيقة إلى خمس دقائق.

بالنسبة للتسجيل في الخلية الكاملة ، يتم استخدام طريقة مشبك التصحيح المثقوب في الغالب. يتم تشكيل gigaseal ، كما هو موضح سابقا ، مع ماصة تحتوي على محلول شبيه بالخلية والأمفوتريسين B. تتم مراقبة مقاومة الوصول باستخدام بروتوكول اختبار الغشاء في برنامج الاستحواذ. بمجرد أن تنخفض مقاومة الوصول إلى أقل من 15 ميغا أوم ، يتم إجراء تعويض مقاومة السلسلة.

عادة ما يكون من الممكن تعويض مقاومة السلسلة بنسبة 75٪ تقريبا في وضع التصحيح المثقوب. يمكن بعد ذلك استخدام خطوات الجهد أو بروتوكولات المنحدر لقياس تيارات الخلية الكاملة. بعد تفكك شبكية العين ، يمكن تحديد الشرايين الأولية والثانوية وما قبل الشعيرات الدموية بناء على عيارها وترتيب خلايا العضلات الملساء الوعائية.

تظهر الشرايين من الدرجة الأولى والثانية متشابهة بصريا تحت الفحص المجهري للمجال الساطع ، ولكن يمكن تمييزها على أساس حجمها. الشرايين قبل الشعيرات الدموية هي أصغر الأوعية الشريانية في المستحضر ويمكن التعرف عليها بسهولة بسبب الترتيب المتقطع لخلايا العضلات الملساء الوعائية. يمكن تمييز الشرايين المعزولة بوضوح عن الشعيرات الدموية والأوردة داخل العزلة.

تظهر الشعيرات الدموية كشبكة من الأوعية ذات العيار الصغير التي يبلغ قطرها حوالي أربعة إلى 10 ميكرومترات ، في حين أن الأوردة رقيقة الجدران وتفتقر إلى تغطية خلايا العضلات الملساء. الشرايين الأولية والثانوية وما قبل الشعيرات الدموية مناسبة لتصوير عضل الضغط وتصوير الكالسيوم ودراسات المشبك التصحيحي. باستخدام الشرايين المضغوطة ، قمنا بالتحقيق في الآليات الجزيئية المشاركة في توليد الاستجابة العضلية.

تظهر الصور المجهرية في هذه الصورة شريانيا شبكية الفئران في نقاط زمنية مختلفة أثناء تجربة التصوير العضلي بالضغط. يوضح مخطط المسار الزمني أدناه التغيرات في قطر الوعاء خلال التجربة الكاملة. مباشرة عند الضغط ، يتمدد الوعاء الدموي ، ثم يتبعه انقباض عضلي نشط يصل إلى مستوى الحالة المستقرة بعد 15 دقيقة.

تؤدي إضافة نبات الورتمانين في محلول هانكس الخالي من الكالسيوم في نهاية التجربة إلى توسيع الوعاء إلى قطره السلبي لأغراض التطبيع. تعرض هذه الشريحة مثالا على تسجيل مشبك رقيع أحادي القناة من خلية عضلة ملساء في الشريان الشبكي قبل تمدد الغشاء وبعده. تحتوي هذه الرقعة الموجودة على الخلية على قناتين TRPV2 يتم تنشيطه بالتمدد ، يزداد نشاطهما مع تطبيق الضغط السلبي على ماصة التصحيح.

تتطلب البروتوكولات الموضحة هنا ممارسة، ولكن يجب أن تكون قابلة للتحقيق بأقل قدر من استكشاف الأخطاء وإصلاحها. نوصي باستخدام الشرايين المعزولة في نفس يوم العزل. تم تحسين الطريقة لشرايين شبكية الفئران ، ولكن يمكن استخدامها على شبكية الفئران.

لقد استخدمنا الآن هذا المستحضر على نطاق واسع ، ولكن حيثما أمكن ، نحاول أيضا التحقق من صحة النتائج الرئيسية التي توصلنا إليها باستخدام حوامل الشبكية الكاملة خارج الجسم الحي وقياسات في الجسم الحي لقطر الأوعية الدموية وتدفق الدم.