الاستشعار الحيوي البصري
تستخدم المستشعرات الحيوية الضوئية الضوء للكشف عن ارتباط الجزيء المستهدف. يمكن لهذه المستشعرات استخدام جزيء الملصق ، الذي ينتج إشارة قابلة للقياس مثل ا…
المستشعرات الحيوية البصرية هي أجهزة استشعار تكتشف هدفا بيولوجيا أو أهدافا ذات أهمية باستخدام الضوء. وجدت هذه الأجهزة تطبيقات في الرعاية الصحية والمستحضرات الصيدلانية والمراقبة البيئية والأمن الداخلي وحتى ساحة المعركة. تنقسم المستشعرات الحيوية الضوئية على نطاق واسع إلى أجهزة استشعار قائمة على الملصقات وخالية من الملصقات. مثال على الاستشعار القائم على التسمية هو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو PCR ، الذي يستخدم ملصقات الفلورسنت ، أو الفلوروفورات ، لتحديد كمية الحمض النووي المستهدف المضخم. مثال على طريقة خالية من الملصقات هو Surface Plasmon Resonance أو SPR. هنا ، يتم قياس تفاعل الجزيئات الحيوية غير المتغيرة مع سطح المستشعر عن طريق قياس خاصية أساسية للمستشعر ، مثل زاوية الانعكاس. يستعرض هذا الفيديو أساسيات هذين النوعين من تقنيات الاستشعار الحيوي البصري ومكوناتها الهامة ومبادئ العمل والتطبيقات الشائعة لأجهزة الاستشعار الحيوية البصرية.
أولا ، دعونا نلقي نظرة على المبادئ العامة للاستشعار الحيوي البصري القائم على الملصقات. عادة ما يتم توصيل مسبار أو عنصر التعرف الحيوي ، مثل الجسم المضاد التكميلي ، على سطح المستشعر باستخدام كيمياء الشلل التقليدية. ثم يتم تدفق محلول العينة على سطح المستشعرات. يتم التقاط الجزيء المستهدف ، وهو مكمل لعنصر التعرف الحيوي الثابت ، بشكل انتقائي من محلول العينة المعقد. ثم يتم غسل محلول العينة الزائد بالمخزن المؤقت أو الماء. بعد ذلك ، للمساعدة في تصور وتحديد كمية الهدف المرتبط ، يتم تدفق جزيء ثانوي مكمل للهدف ومتصل بالفلوروفور عبر النظام. بعد مرور بعض الوقت ، عندما يحدث ارتباط الجزيء الثانوي بالهدف ، يتم غسل الفلوروفور الزائد غير المرتبط. يمكن بعد ذلك قياس شدة الفلوروفور المرتبط باستخدام مجهر الفلورسنت. يتم رسم هذه الشدة أولا لتركيزات الهدف المختلفة المعروفة لإنشاء منحنى معايرة ، والذي يسمح بعد ذلك بالقياس المباشر لكمية غير معروفة من الهدف الذي تم التقاطه. وبالتالي ، تستخدم التقنيات القائمة على الملصقات شدة التألق للفلوروفورات شديدة الحساسية لتحديد تركيز الجزيء الحيوي المعني.
الآن بعد أن راجعنا مبادئ أجهزة الاستشعار الحيوية البصرية القائمة على الملصقات ، دعنا نلقي نظرة على مثال شائع الاستخدام ، وهو المعيار الحالي لتضخيم الحمض النووي ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، أو qPCR. يشتمل مزيج تفاعل qPCR على مسبار مسمى لقياس التفاعل في الوقت الفعلي. يتم إرفاق تسلسل المسبار بكل من جزيئات مراسل الفلورسنت وجزيئات التبريد ، ويرتبط بتسلسل DNA معين. يعمل جزيء التبريد على إخماد انبعاث الفلوروفور بينما يرتبط كلاهما بالمسبار. أثناء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يحلل إنزيم البوليميراز الحمض النووي للمسبار ويفصل جسديا مراسل الفلوروفور ، وبالتالي يمنع التبريد ويؤدي إلى زيادة التألق. لإجراء qPCR ، أضف أولا جميع مكونات التفاعل ، بما في ذلك المجسات المسماة ، في أنبوب PCR أو بئر. بعد ذلك ، ضع آبار PCR في جهاز تدوير حراري متخصص وأدخل المعلمات لكل دورة وعدد الدورات. يشتمل جهاز التدوير الحراري المستخدم في qPCR على مصدر ضوء مع المكونات البصرية المطلوبة لتحديد الطول الموجي وكاشف لقياس شدة التألق في الوقت الفعلي أثناء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). في نهاية كل دورة حرارية ، يتم تسجيل شدة الفلورسنت الناتجة عن الفلوروفورات المنبعثة ورسمها. تتناسب شدة الفلورسنت طرديا مع لوغاريتم التركيز المستهدف في بئر التفاعل ، وبالتالي ، بالنسبة للتألق المعروف ، يمكن حساب التركيز المستهدف غير المعروف.
دعونا الآن نلقي نظرة على كيفية تحقيق الاستشعار بدون أي مراسلين ، مثل الفلوروفورات ، باستخدام تقنيات الاستشعار البصري الخالية من الملصقات. بالنسبة للتقنيات الخالية من الملصقات ، فإن تثبيت عنصر التعرف الحيوي هو نفس التقنية القائمة على الملصق. أي ارتباط جزيئي حيوي بسطح هذه المستشعرات يعدل معامل الانكسار في المنطقة المجاورة مباشرة للجهاز البصري. ترتبط الجزيئات المستهدفة بسطح الجهاز البصري الوظيفي لتشكيل طبقة رقيقة وتعديل معامل الانكسار. يمكن مراقبة هذه التغيرات في معامل الانكسار من خلال تتبع التغير في التردد الطبيعي للاهتزاز ، أو تردد الرنين للنظام. يتناسب الاختلاف في ترددات الرنين قبل وبعد ربط الهدف ، والذي يسمى التحول f ، طرديا مع تركيز الهدف الذي تم التقاطه.
الآن دعنا نلقي نظرة على المبادئ الأساسية لتقنية الاستشعار البصري الخالية من الملصقات شائعة الاستخدام ، أو رنين البلازمون السطحي ، أو SPR. تجمع أداة SPR النموذجية بين مصدر ليزر متحرك ، وكاشف بصري لقياس تحول الشدة ، وشريحة مستشعر مع منشور زجاجي مطلي على جانب واحد بالذهب. تم دمج المنشور المغطى بالذهب مع نظام سائل يتيح عملية التدفق. في التجربة ، يتم إرفاق جزيء المسبار ، أو عنصر التعرف الحيوي ، على سطح الذهب. ثم يتدفق العنصر المستهدف على السطح ويرتبط بالمسبار الثابت. يستخدم الاستشعار ظاهرة SPR. يحدث هذا عندما يظهر الضوء المستقطب على سطح المعدن ، مثل الذهب ، بزاوية معينة ، ثيتا SPR. ينتج عن هذا توليد البلازمونات السطحية وهي تذبذبات إلكترونية متماسكة موجودة عند واجهة مادتين لهما سماحيات لعلامات معاكسة. عندما تتغير الكتلة المتصلة بسطح المستشعر ، تتغير حالة الرنين للبلازمونات السطحية. وبالتالي ، عندما يكون عنصر التعرف الحيوي فقط مرتبطا على السطح ، ينعكس الشعاع بزاوية واحدة ، ثيتا واحدة. بعد ذلك ، عندما يتم ربط المزيد من الكتلة بالسطح ، مثل الهدف الذي تم التقاطه ، يتم تقليل شدة الضوء المنعكس بزاوية محددة ، يتم ملاحظة ثيتا SPR ، حيث تتغير زاوية الانعكاس إلى ثيتا اثنين. التغير في شدة الضوء المنعكس عند زاوية الرنين ، ثيتا SPR ، هو دالة لزاوية الضوء المنعكس ، ويمكن قياسه على أنه الفرق في الزوايا ، ثيتا واحد وثيتا اثنين.
الآن بعد أن غطينا المبادئ والإجراءات الكامنة وراء أجهزة الاستشعار الحيوية البصرية ، دعنا نرى كيف يطبق الباحثون هذه التقنيات اليوم. مقياس الخلوي لخلية التدفق هو نظام استشعار حيوي بصري يستخدم بشكل شائع لحساب الخلايا وقياس مجموعة متنوعة من الخصائص والمكونات الخلوية الأخرى. يتم تحضير عينة تتكون من أنواع متعددة من الخلايا ، كل منها موسومة بفلوروفور فريد ، في تعليق. بعد ذلك ، يتم تشغيل العينة من خلال مقياس التدفق الخلوي بحيث تمر الخلايا عبر شعاع الليزر واحدة تلو الأخرى. عندما تمر كل خلية عبر شعاع الليزر ، يتم تحديد ضوء الفلورسنت المتناثر والمنبعث من الفلوروفورات المختلفة بشكل منفصل ، مما يعطي إحصاء مباشرا لأنواع الخلايا المختلفة في العينة. تطبيق آخر لأجهزة الاستشعار الحيوية البصرية هو الكشف عن البكتيريا في العينات. تتمثل إحدى طرق القيام بذلك في استخدام مستشعرات الرنان الحلقي البصري. وهي تتكون من حلقة مغلقة مقترنة بأدلة موجات الإدخال والإخراج الخفيفة. عندما يتم تطبيق ضوء الطول الموجي للرنين على دليل موجة الإدخال ، يتم تمريره عبر الحلقة ويتراكم شدة على مدى رحلات ذهابا وإيابا متعددة بسبب التداخل البناء ويتم إخراجه إلى دليل موجة الإخراج. يتم تثبيت الأجسام المضادة الخاصة بالبروتينات السطحية البكتيرية على سطح المرنان الحلقي ويتم الحصول على طيف امتصاص أساسي. ثم تتدفق العينة البكتيرية على سطح المرنان للسماح بالارتباط البكتيري بالجسم الثابت ، وبعد ذلك يتم الحصول على طيف امتصاص ثان. إذا ارتبطت البكتيريا ذات الأهمية ، لوحظ تحول مرئي في قمم الرنين ، وهو ما يتناسب طرديا مع تركيز البكتيريا المستهدفة.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول الاستشعار الحيوي البصري. ناقشنا المبادئ الأساسية لكل من الاستشعار البصري القائم على الملصقات والخالي من الملصقات جنبا إلى جنب مع مثالين بارزين لهذه الطرق وبعض تطبيقات التقنيات. شكرا للمشاهدة.
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
المستشعرات الحيوية البصرية هي أجهزة استشعار تكتشف هدفا بيولوجيا أو أهدافا ذات أهمية باستخدام الضوء. وجدت هذه الأجهزة تطبيقات في الرعاية الصحية والمستحضرات الصيدلانية والمراقبة البيئية والأمن الداخلي وحتى ساحة المعركة. تنقسم المستشعرات الحيوية الضوئية على نطاق واسع إلى أجهزة استشعار قائمة على الملصقات وخالية من الملصقات. مثال على الاستشعار القائم على التسمية هو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو PCR ، الذي يستخدم ملصقات الفلورسنت ، أو الفلوروفورات ، لتحديد كمية الحمض النووي المستهدف المضخم. مثال على طريقة خالية من الملصقات هو Surface Plasmon Resonance أو SPR. هنا ، يتم قياس تفاعل الجزيئات الحيوية غير المتغيرة مع سطح المستشعر عن طريق قياس خاصية أساسية للمستشعر ، مثل زاوية الانعكاس. يستعرض هذا الفيديو أساسيات هذين النوعين من تقنيات الاستشعار الحيوي البصري ومكوناتها الهامة ومبادئ العمل والتطبيقات الشائعة لأجهزة الاستشعار الحيوية البصرية.
أولا ، دعونا نلقي نظرة على المبادئ العامة للاستشعار الحيوي البصري القائم على الملصقات. عادة ما يتم توصيل مسبار أو عنصر التعرف الحيوي ، مثل الجسم المضاد التكميلي ، على سطح المستشعر باستخدام كيمياء الشلل التقليدية. ثم يتم تدفق محلول العينة على سطح المستشعرات. يتم التقاط الجزيء المستهدف ، وهو مكمل لعنصر التعرف الحيوي الثابت ، بشكل انتقائي من محلول العينة المعقد. ثم يتم غسل محلول العينة الزائد بالمخزن المؤقت أو الماء. بعد ذلك ، للمساعدة في تصور وتحديد كمية الهدف المرتبط ، يتم تدفق جزيء ثانوي مكمل للهدف ومتصل بالفلوروفور عبر النظام. بعد مرور بعض الوقت ، عندما يحدث ارتباط الجزيء الثانوي بالهدف ، يتم غسل الفلوروفور الزائد غير المرتبط. يمكن بعد ذلك قياس شدة الفلوروفور المرتبط باستخدام مجهر الفلورسنت. يتم رسم هذه الشدة أولا لتركيزات الهدف المختلفة المعروفة لإنشاء منحنى معايرة ، والذي يسمح بعد ذلك بالقياس المباشر لكمية غير معروفة من الهدف الذي تم التقاطه. وبالتالي ، تستخدم التقنيات القائمة على الملصقات شدة التألق للفلوروفورات شديدة الحساسية لتحديد تركيز الجزيء الحيوي المعني.
الآن بعد أن راجعنا مبادئ أجهزة الاستشعار الحيوية البصرية القائمة على الملصقات ، دعنا نلقي نظرة على مثال شائع الاستخدام ، وهو المعيار الحالي لتضخيم الحمض النووي ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، أو qPCR. يشتمل مزيج تفاعل qPCR على مسبار مسمى لقياس التفاعل في الوقت الفعلي. يتم إرفاق تسلسل المسبار بكل من جزيئات مراسل الفلورسنت وجزيئات التبريد ، ويرتبط بتسلسل DNA معين. يعمل جزيء التبريد على إخماد انبعاث الفلوروفور بينما يرتبط كلاهما بالمسبار. أثناء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يحلل إنزيم البوليميراز الحمض النووي للمسبار ويفصل جسديا مراسل الفلوروفور ، وبالتالي يمنع التبريد ويؤدي إلى زيادة التألق. لإجراء qPCR ، أضف أولا جميع مكونات التفاعل ، بما في ذلك المجسات المسماة ، في أنبوب PCR أو بئر. بعد ذلك ، ضع آبار PCR في جهاز تدوير حراري متخصص وأدخل المعلمات لكل دورة وعدد الدورات. يشتمل جهاز التدوير الحراري المستخدم في qPCR على مصدر ضوء مع المكونات البصرية المطلوبة لتحديد الطول الموجي وكاشف لقياس شدة التألق في الوقت الفعلي أثناء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). في نهاية كل دورة حرارية ، يتم تسجيل شدة الفلورسنت الناتجة عن الفلوروفورات المنبعثة ورسمها. تتناسب شدة الفلورسنت طرديا مع لوغاريتم التركيز المستهدف في بئر التفاعل ، وبالتالي ، بالنسبة للتألق المعروف ، يمكن حساب التركيز المستهدف غير المعروف.
دعونا الآن نلقي نظرة على كيفية تحقيق الاستشعار بدون أي مراسلين ، مثل الفلوروفورات ، باستخدام تقنيات الاستشعار البصري الخالية من الملصقات. بالنسبة للتقنيات الخالية من الملصقات ، فإن تثبيت عنصر التعرف الحيوي هو نفس التقنية القائمة على الملصق. أي ارتباط جزيئي حيوي بسطح هذه المستشعرات يعدل معامل الانكسار في المنطقة المجاورة مباشرة للجهاز البصري. ترتبط الجزيئات المستهدفة بسطح الجهاز البصري الوظيفي لتشكيل طبقة رقيقة وتعديل معامل الانكسار. يمكن مراقبة هذه التغيرات في معامل الانكسار من خلال تتبع التغير في التردد الطبيعي للاهتزاز ، أو تردد الرنين للنظام. يتناسب الاختلاف في ترددات الرنين قبل وبعد ربط الهدف ، والذي يسمى التحول f ، طرديا مع تركيز الهدف الذي تم التقاطه.
الآن دعنا نلقي نظرة على المبادئ الأساسية لتقنية الاستشعار البصري الخالية من الملصقات شائعة الاستخدام ، أو رنين البلازمون السطحي ، أو SPR. تجمع أداة SPR النموذجية بين مصدر ليزر متحرك ، وكاشف بصري لقياس تحول الشدة ، وشريحة مستشعر مع منشور زجاجي مطلي على جانب واحد بالذهب. تم دمج المنشور المغطى بالذهب مع نظام سائل يتيح عملية التدفق. في التجربة ، يتم إرفاق جزيء المسبار ، أو عنصر التعرف الحيوي ، على سطح الذهب. ثم يتدفق العنصر المستهدف على السطح ويرتبط بالمسبار الثابت. يستخدم الاستشعار ظاهرة SPR. يحدث هذا عندما يظهر الضوء المستقطب على سطح المعدن ، مثل الذهب ، بزاوية معينة ، ثيتا SPR. ينتج عن هذا توليد البلازمونات السطحية وهي تذبذبات إلكترونية متماسكة موجودة عند واجهة مادتين لهما سماحيات لعلامات معاكسة. عندما تتغير الكتلة المتصلة بسطح المستشعر ، تتغير حالة الرنين للبلازمونات السطحية. وبالتالي ، عندما يكون عنصر التعرف الحيوي فقط مرتبطا على السطح ، ينعكس الشعاع بزاوية واحدة ، ثيتا واحدة. بعد ذلك ، عندما يتم ربط المزيد من الكتلة بالسطح ، مثل الهدف الذي تم التقاطه ، يتم تقليل شدة الضوء المنعكس بزاوية محددة ، يتم ملاحظة ثيتا SPR ، حيث تتغير زاوية الانعكاس إلى ثيتا اثنين. التغير في شدة الضوء المنعكس عند زاوية الرنين ، ثيتا SPR ، هو دالة لزاوية الضوء المنعكس ، ويمكن قياسه على أنه الفرق في الزوايا ، ثيتا واحد وثيتا اثنين.
الآن بعد أن غطينا المبادئ والإجراءات الكامنة وراء أجهزة الاستشعار الحيوية البصرية ، دعنا نرى كيف يطبق الباحثون هذه التقنيات اليوم. مقياس الخلوي لخلية التدفق هو نظام استشعار حيوي بصري يستخدم بشكل شائع لحساب الخلايا وقياس مجموعة متنوعة من الخصائص والمكونات الخلوية الأخرى. يتم تحضير عينة تتكون من أنواع متعددة من الخلايا ، كل منها موسومة بفلوروفور فريد ، في تعليق. بعد ذلك ، يتم تشغيل العينة من خلال مقياس التدفق الخلوي بحيث تمر الخلايا عبر شعاع الليزر واحدة تلو الأخرى. عندما تمر كل خلية عبر شعاع الليزر ، يتم تحديد ضوء الفلورسنت المتناثر والمنبعث من الفلوروفورات المختلفة بشكل منفصل ، مما يعطي إحصاء مباشرا لأنواع الخلايا المختلفة في العينة. تطبيق آخر لأجهزة الاستشعار الحيوية البصرية هو الكشف عن البكتيريا في العينات. تتمثل إحدى طرق القيام بذلك في استخدام مستشعرات الرنان الحلقي البصري. وهي تتكون من حلقة مغلقة مقترنة بأدلة موجات الإدخال والإخراج الخفيفة. عندما يتم تطبيق ضوء الطول الموجي للرنين على دليل موجة الإدخال ، يتم تمريره عبر الحلقة ويتراكم شدة على مدى رحلات ذهابا وإيابا متعددة بسبب التداخل البناء ويتم إخراجه إلى دليل موجة الإخراج. يتم تثبيت الأجسام المضادة الخاصة بالبروتينات السطحية البكتيرية على سطح المرنان الحلقي ويتم الحصول على طيف امتصاص أساسي. ثم تتدفق العينة البكتيرية على سطح المرنان للسماح بالارتباط البكتيري بالجسم الثابت ، وبعد ذلك يتم الحصول على طيف امتصاص ثان. إذا ارتبطت البكتيريا ذات الأهمية ، لوحظ تحول مرئي في قمم الرنين ، وهو ما يتناسب طرديا مع تركيز البكتيريا المستهدفة.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول الاستشعار الحيوي البصري. ناقشنا المبادئ الأساسية لكل من الاستشعار البصري القائم على الملصقات والخالي من الملصقات جنبا إلى جنب مع مثالين بارزين لهذه الطرق وبعض تطبيقات التقنيات. شكرا للمشاهدة.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between label-based and label-free optical biosensors?
Label-based biosensors use fluorescent molecules called fluorophores attached to secondary probes to generate measurable signals, such as in quantitative PCR. Label-free biosensors detect binding by monitoring changes in optical properties like refractive index without adding reporter molecules. Both approaches immobilize biorecognition elements on sensor surfaces but differ in how they quantify target binding. Optical and electrochemical biosensors represent complementary detection strategies in modern bioanalysis.
Q2: How does quantitative PCR use fluorescence to measure DNA concentration?
In qPCR, a labeled probe contains both a fluorescent reporter and a quencher molecule that suppresses fluorescence when attached. During PCR amplification, the polymerase degrades the probe, separating the fluorophore from the quencher and releasing fluorescence. The thermocycler measures fluorescent intensity in real time at each cycle, which is directly proportional to the logarithm of target DNA concentration.
Q3: What role does the biorecognition element play in optical biosensing?
The biorecognition element, such as a complementary antibody, is immobilized on the sensor surface using chemical attachment methods. It selectively captures target molecules from complex sample solutions based on molecular specificity. This immobilized probe forms the foundation for both label-based and label-free detection methods by enabling selective binding of targets.
Q4: How does Surface Plasmon Resonance detect target binding without labels?
SPR uses polarized light directed at a gold-coated prism at a specific angle to generate surface plasmons, which are coherent electron oscillations at the metal interface. When target molecules bind to immobilized probes on the gold surface, the mass changes alter the resonance condition. This shifts the angle of reflected light, and the change in reflection intensity at the resonance angle is measured and quantified.
Q5: What is a calibration curve and why is it important in label-based biosensing?
A calibration curve is created by plotting fluorescent intensity measurements against known target concentrations. This curve establishes the relationship between fluorescence signal and target concentration. Once established, the calibration curve allows researchers to determine unknown target concentrations by measuring the fluorescent intensity of unknown samples and referencing the curve.
Q6: How does flow cytometry use optical biosensing to identify cell types?
Flow cytometry prepares cell samples with each cell type tagged with a unique fluorophore. Cells flow past a laser beam one at a time, and scattered and emitted fluorescent light from different fluorophores are separately quantified. This direct measurement provides accurate counts of various cell types in the sample based on their distinct fluorescent signatures.
Q7: How do optical ring resonators detect bacteria in samples?
Optical ring resonators consist of a closed loop coupled to input and output waveguides. Antibodies specific to bacterial surface proteins are immobilized on the resonator surface. When bacterial samples flow over the surface and bind to antibodies, the resonant peaks shift visibly. This shift is directly proportional to bacterial concentration, enabling sensitive detection and quantification.