Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons <em>In Situ</em>

Junhwan Kwon; Myunghwan Choi

doi:10.3791/57965

مجهر ريفليكتوميتريك الطيفية على محاور عصبية ميليناتيد في الموقع

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

مجهر ريفليكتوميتريك الطيفية على محاور عصبية ميليناتيد في الموقع

Full Text

7,749 Views

09:13 min

July 2, 2018

DOI: 10.3791/57965-v

Junhwan Kwon^1,2, Myunghwan Choi^1,2

¹Department of Biomedical Engineering,Sungkyunkwan University, ²Center for Neuroscience Imaging Research,Institute for Basic Science (IBS)

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a technique for imaging myelinated axons in fixed brain slices utilizing a label-free nanoscale imaging approach based on spectral reflectometry. The method enables analysis of myelin plasticity and demyelination without the need for complex sample preparation.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Axon Imaging
Myelin Research

Background

Traditional imaging techniques often require complex labeling.
Understanding myelin plasticity is crucial for insights into neurodegenerative diseases.
The technique can be extended for use in living animals.
Label-free approaches minimize disturbances to tissue structure.

Purpose of Study

To provide a protocol for studying myelinated axons in fixed tissue.
To offer a method for investigating questions surrounding myelin and axonal health.
To demonstrate the application of nanoscale imaging in neuroscience research.

Methods Used

The primary platform used is spectral reflectometry for imaging.
The biological model includes fixed mouse brain slices.
No multiomics or metabolic analyses are mentioned in the study.
Key steps include tissue fixing and slicing before imaging.
Nail polish is used to seal coverslips for preventing contamination.

Main Results

SpeRe imaging accurately localized signals along myelinated axons.
The method produced results in alignment with traditional fluorescence techniques.
No saturation was observed in spectral imaging, validating the reliability of the technique.
The imaging allowed for measurement of axon diameter correlating well with fluorescence-based results.

Conclusions

This study enables effective imaging of myelinated axons without complex preparations.
The technique aids in understanding myelination mechanisms and their plasticity.
It presents potential for adaptations in studying living tissues and other neurological questions.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of this imaging technique?

The label-free nanoscale imaging technique allows researchers to study myelinated axons without the complications of dye-based labeling.

How is the biological model implemented?

The biological model involves fixing and slicing mouse brain tissue, which is then prepared for imaging using the spectral reflectometry technique.

What types of data are obtained from the imaging?

Data includes the localization of reflectant spectra along myelinated axons and measurements of axon diameter.

How can this method be adapted for living animals?

The protocols can be extended from fixed tissue to living models, enhancing its utility in dynamic studies of myelination.

What are the key limitations of this technique?

Background noise can occur due to the use of silica coverslips, which may affect imaging quality if not properly managed.

What critical steps are involved in the imaging process?

Key steps include glass slide preparation, tissue placement, and careful sealing to prevent contamination before imaging.

Can this technique be used for other types of neural studies?

While specifically aimed at studying myelin, adaptations for other neural structures may be possible, pending validation.

نقدم هنا، بروتوكول خطوة بخطوة للتصوير محاور عصبية myelinated في شريحة الدماغ ثابت باستخدام النانو خالية من التسمية التصوير تقنية تستند إلى ريفليكتوميتري الطيفية.

يمكن أن تساعد هذه التقنية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المايلين ، مثل لدونة المايلين وإزالة الميالين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة البنية النانوية للمحور العصبي النخاعي في أنسجة المخ السليمة دون أي وضع علامات معقدة أو تحضير عينة. هنا ، سنوضح على التطبيق في شريحة دماغية ، ولكن يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل الحية.

بعد إصلاح أنسجة دماغ الفأر وتقطيعها وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد شريحة زجاجية واحدة واثنين من كأسي الغطاء لكل شريحة من الأنسجة. استخدم قطاعة زجاجية لقطع أحد أكواب الغطاء المربع إلى نصفين. بعد ذلك ، قم بإنشاء فاصل باستخدام superglue لربط القطعتين بالشريحة الزجاجية.

باستخدام فرشاة أو ماصة ، احصد شريحة من الدماغ وضع الأنسجة على شريحة زجاجية بين الفاصل ، مع الحرص على عدم طي الأنسجة. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من PBS على سطح الأنسجة. بعد ذلك ، ضع زجاج الغطاء المربع الثاني في الجزء العلوي من المنديل مع تجنب إدخال فقاعات الهواء.

استخدم طلاء الأظافر لإغلاق زجاج الغطاء لمنع تبخر PBS والتلوث بالغبار أثناء جلسة التصوير اللاحقة. قبل ساعة واحدة على الأقل من التصوير ، قم بتشغيل المجهر للسماح بالتثبيت الحراري لمصدر الليزر. ثم قم بتشغيل برنامج المسح الطيفي وانقر فوق الزر الحصول أعلى واجهة المستخدم الرسومية.

قم بتشغيل غالق البرنامج لليزر الضوء الأبيض وأنبوب المضاعف الضوئي. ضمن وضع الاستحواذ، حدد وضع XY lambda في القائمة المنسدلة. ثم يتم تغيير وضع إدخال الليزر تلقائيا من نسبة مئوية ثابتة إلى طاقة ثابتة.

تحت إثارة lambda ، إعدادات مسح lambda ، قم بإلغاء تحديد مربع حركة SP التلقائي واضبط النافذة الطيفية لليزر المدخل على 470 إلى 670 نانومتر وحجم الخطوة الطيفية إلى أربعة نانومتر. اضبط النطاق الطيفي ل PMT على 450 إلى 690 نانومتر عن طريق النقر المزدوج أو تحريك شريط الضبط للنطاق الطيفي. حدد عدسة موضوعية للغمر في الماء بشكل مناسب بفتحة عدلية عالية.

أعط أي قيمة ل PMT وطاقة الليزر لتنشيط تكوين AOBS وزر المسح المباشر. ضمن تكوين AOBS، قم بالتبديل إلى المسار البصري عن طريق التحقق من الانعكاس. بعد ذلك ، قم بتركيب مرآة مرجعية على مسرح المجهر بحيث يكون السطح مواجها للعدسة الشيئية.

إذا لم يكن من السهل وضع المرآة على مرحلة المجهر ، فقم بلصق مرآة على اللوحة المسطحة. اضبط مرحلة المجهر لمحاذاة المستوى البؤري مع سطح المرآة. بعد ذلك ، اضبط كسب PMT وقوة الليزر ، مع مراعاة النطاق الديناميكي للكاشف.

تحت لون زائف ، تحقق من عدم وجود تشبع في جميع أنحاء نطاق الطول الموجي. إذا لوحظ التشبع ، فقم بخفض طاقة الليزر. ثم قم بتشغيل اكتساب مسح lambda.

قم بإزالة المرآة من المسرح وكرر نفس الاستحواذ بدون عينة من أجل الحصول على المرجع المظلم. ثم احفظ البيانات بتنسيق TIF متعدد المكدسات. لإجراء الحصول على صورة SpeRe ، ضع الأنسجة المثبتة على مرحلة المجهر.

لمحاذاة الأنسجة تقريبا مع المستوى البؤري للعدسة الشيئية ، من خلال العدسة ، استخدم وضع التألق واسع المجال. مع تشغيل الفحص المباشر ، تحكم في مرحلة المجهر لمحاذاة المستوى البؤري مع منطقة الاهتمام في الأنسجة. لتجنب ضوضاء الخلفية من الغطاء ، حدد منطقة مستهدفة بعمق 15 ميكرومتر على الأقل من واجهة الأنسجة الزجاجية.

احصل على مكدس الصور الطيفية للمنطقة المستهدفة باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. ثم احفظ البيانات للأنسجة والإزاحة الداكنة بتنسيق TIF متعدد المكدسات. لمعالجة الصور في ImageJ، افتح البيانات الطيفية للمرآة المرجعية وأنسجة الدماغ.

حدد عائد الاستثمار لمكدسات الصور المفتوحة ، والمنطقة المركزية للمرآة المرجعية ، وجزء من ألياف محورية لأنسجة الدماغ. ثم قم بتشغيل الصورة والمكدسات والمخططات لملف تعريف المحور Z للحصول على الأطياف الأولية لعائد الاستثمار المحدد. قد تكون ألياف المحور العصبي غير متجانسة هيكليا على طول أطوالها ، وبالتالي ، يوصى باختيار عائد الاستثمار على جزء محوري صغير عادة أقل من خمسة ميكرومتر لتقليل القطع الأثرية ذات الحجم الجزئي.

افتح بيانات الإزاحة المظلمة ، أحدها مأخوذ للمرآة المرجعية والآخر مأخوذ لأنسجة المخ ، وارسم ملف تعريف المحور Z كما هو موضح للتو. ثم استخدم خيارات النسخ واللصق لحفظ جميع الخيارات المكتسبة. لإجراء تصحيح خط الأساس وتحليل إشارة SpeRe ، اطرح أطياف الإزاحة من أطياف المرآة المرجعية وأنسجة المخ.

تطبيع كل طيف بقسمة أقصى كثافة للطيف. أدخل الرقم الموجي عن طريق أخذ مقلوب الطول الموجي المستخدم في التجربة ، وتطبيع طيف المحور العصبي بقسمة الطيف الخاص بالمرآة المرجعية ، وطرح إزاحة التيار المستمر من الطيف الطبيعي. ثم احصل على تردد الرقم الموجي عن طريق تركيب الطيف المكتسب على الجيوب الأنفية.

قم بتحويل تردد الرقم الموجي المكتسب إلى دورية عن طريق أخذ المقلوب وتحويل دورية الرقم الموجي إلى قطر المحور العصبي باستخدام المعادلة الموضحة هنا. في هذه التجربة ، تم تلطيخ شرائح الدماغ الثابتة بالفلورسنت ضد المايلين وتم إجراء تصوير SpeRe بجرعة خفيفة أقل من الفحص المجهري متحد البؤر الفلوري التقليدي. تم توطين إشارة SpeRe على طول مركز المحاور النخاعية كما هو متوقع من خلال هندسة الانعكاس البصري.

من الطيف العاكس لمقطع محوري ، تم الحصول على دورية الرقم الموجي ، والتي تم تحويلها لاحقا إلى قطر المحور العصبي. يوضح هذا الرسم البياني ملفا عرضيا لشدة التألق من المنطقة المعبأة هنا ، ووجد أن القطر الذي تم قياسه بواسطة SpeRe يتفق بشكل جيد مع القياس القائم على التألق. يعتمد تصوير SpeRe على الانعكاس البصري.

وبالتالي ، يمكن أن يؤدي الغطاء القائم على السيليكا إلى حدوث ضوضاء كبيرة في الخلفية. في إعداد البصريات ، كانت ضوضاء الخلفية كبيرة عندما كان عمق التصوير من الغطاء أقل من خمسة ميكرومتر ولكن تم تجنبه عندما يكون عمق التصوير أكبر من 15 ميكرومتر. خطوة المعايرة ليست مطلوبة لكل تجربة ولكن يوصى بها مرة واحدة على الأقل في الأسبوع.

بمجرد اكتمال المعايرة، يمكن الانتهاء من إجراء التصوير عادة في غضون 20 ثانية لكل مجال رؤية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراعاة زمن الوصول الديناميكي للكاشف للمسح الضوئي الكامل للأطياف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على البنية النانوية من المحاور النخاعية باستخدام صور الانعكاس.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos