مقايسة تنحية نازعة لاكتات — طريقة بسيطة وموثوق بها لتحديد النشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الالتهام الذاتي ، مثل كيفية تنظيم تكوين البلعمة الذاتية وكيف تؤثر علاجات الخلايا المختلفة وظروفها على الالتهام الذاتي السائب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقيس عزل البضائع الداخلية. لذلك ، فإن الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع ومستقلة عن الإفراط في التعبير الاصطناعي أو إدخال مجسات البضائع.

يوضح الإجراء ، بولا زالاي ومورتن لوهر ، طلاب الدكتوراه من مختبري. للبدء ، قم بزراعة الخلايا الملتصقة في قوارير زراعة الأنسجة التي تبلغ مساحتها 75 سنتيمترا مربعا في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. اسمح للخلايا بالنمو حتى تصل إلى طبقة خلية قريبة من التقاء.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا بثلاثة ملليلتر من PBS عند 37 درجة مئوية في درجة الحموضة 7.4. قم بإزالة PBS واستبدله بثلاثة ملليلتر من 0.25٪ تريبسين EDTA. احتضان في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية ، حتى تنفصل الخلايا.

بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في سبعة ملليلتر من وسط الثقافة الذي يحتوي على 10٪ FBS ، ونقلها إلى أنبوب معقم سعة 50 ملليلترا. باستخدام طرف ماصة من 0.5 إلى 20 ميكرولتر ، انقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق. استخدم نفس طرف الماصة لملء شريحة غرفة العد على الفور وعد الخلايا في عداد خلوي آلي.

ثم استخدم وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ FBS لتحضير التخفيف المناسب لتعليق الخلية. باستخدام تقنيات معقمة ، قم بزرع مليلتر واحد من تعليق الخلية المخفف في كل بئر من لوحة زراعة أنسجة 12 جيدا. احتضان في حاضنة مرطبة ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى كثافة الخلية المطلوبة.

في العلاجات التجريبية المرغوبة ، ترك مجموعة واحدة من الآبار غير المعالجة من أجل تحديد مستويات خلفية LDH القابل للترسيب. قبل ثلاث إلى أربع ساعات من الحصاد ، أضف كمية مشبعة من مثبط ما بعد العزل Bafilomycin A1 إلى كل بئر. احتضن في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية.

في نهاية فترة العلاج ، تقوم بالشفط لشفط الوسط. أضف 200 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية لكل بئر. احتضن عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا.

أضف 500 ميكرولتر من PBS بدرجة حرارة الغرفة عند درجة الحموضة 7.4 التي تحتوي على 2٪ BSA لكل بئر. باستخدام ماصة ، أعد تعليق كل بئر حتى لا تظهر كتل الخلايا. بعد ذلك ، قم على الفور بنقل تعليق الخلية في كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل سعة 1.5 مل على الجليد.

الطرد المركزي الأنابيب عند 400 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق لترسيب الخلايا. استخدم الشفط لشفط المادة الطافية تماما ، وترك كريات الخلية جافة قدر الإمكان. ثم أضف 400 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على 10٪ سكروز في ماء نقي للغاية إلى كل أنبوب.

باستخدام ماصة ، أعد تعليق حبيبات الخلية للحصول على تعليق قريب من خلية واحدة. انقل هذا التعليق إلى كوفيت كهربائي بسعة أربعة ملليمترات. ضع الكوفيت في مثقب كهربائي لموجة الاضمحلال الأسية وقم بتفريغ نبضة كهربائية واحدة عند 800 فولت و 25 ميكروفاراد و 400 أوم.

استخدم طرف ماصة جديدا لنقل خلية الاضطراب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 400 ميكرولتر من محلول السكروز المخزن بالفوسفات المثلج وخلطه لفترة وجيزة عن طريق سحب العينات. كرر عملية إعادة التعليق والتعطيل الكهربائي والخلط لكل عينة. في حالة تنفيذ الإجراء لأول مرة ، تأكد من التحقق من التعطيل الكهربائي لغشاء البلازما الفعال والانتقائي كما هو موضح في النص.

للحصول على كسور LDH المترسوبة ، قم بإزالة 550 ميكرولترا من كل محلول مخفف لتعطيل الخلية ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة ملليلترين يحتوي على 900 ميكرولتر من محلول إعادة التعليق المثلج البارد مع 0.5٪ BSA و 0.01٪ Tween 20. الماصة لفترة وجيزة للخلط. جهاز طرد مركزي عند 18،000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة لإنتاج كريات تحتوي على LDH مرسوب.

باستخدام الشفط ، قم بشفط المادة الطافية جيدا لترك الكريات جافة قدر الإمكان. قم بتخزين عينات LDH المترسوبة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للتحليل. بالنسبة لإجمالي كسور LDH ، انقل 150 ميكرولترا من كل من المحاليل المخففة لتعطيل الخلية إلى الأنبوب الجديد الخاص بها.

قم بتخزينها في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للتحليل. قم بإذابة كل من LDH المترسب وإجمالي عينات LDH على الجليد. بمجرد إذابة الجليد ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق المثلج البارد الذي يحتوي على 1.5٪ Triton X-405 إلى إجمالي عينات LDH.

قم بتدوير العينات على أسطوانة في غرفة باردة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 750 ميكرولترا من المخزن المؤقت لإعادة التعليق المثلج البارد الذي يحتوي على 1٪ Triton X-405 إلى عينات LDH المترسبة. استخدم ماصة لإعادة تعليق الكريات حتى يصبح المحلول متجانسا.

الطرد المركزي جميع العينات عند 18,000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق لترسيب الحطام الخلوي غير الذائب. بعد اكتمال الطرد المركزي ، ضع العينات على الجليد. تحديد مستويات LDH في المواد الطافية باستخدام إما اختبار إنزيمي كلاسيكي كما هو موضح في النص أو أي من مجموعة متنوعة من المجموعات المتاحة تجاريا.

في هذه الدراسة ، يتم مراقبة نشاط عزل البلع الذاتي السائب في عدد من خطوط خلايا الثدييات المختلفة. كما هو موضح هنا ، يتم إلغاء كل من عزل LDH الأساسي والناجم عن الجوع وخلايا LNCaP تماما بواسطة مثبط pan-PI3-kinase ، 3MA. مثبط PI3-kinase الانتقائي من الفئة الثالثة ، SAR-405 ومثبط مضخة الكالسيوم ER ، Thapsigargin.

في خلايا HEK293 ، يتم تقليل عزل LDH في ظل ظروف الجوع بشدة بواسطة كل من Thapsigargin ومثبط ULK ، MRT 67307. علاوة على ذلك ، يظهر أن عزل LDH الناجم عن الجوع يتم تثبيطه باستمرار بواسطة 3MA في خطوط الخلايا الأخرى المرصودة. بعد ذلك ، يتم استخدام العديد من MEFs بالضربة القاضية لجين ATG لاختبار ما إذا كانت الجينات المتعلقة بالالتهام الذاتي التي تم الإبلاغ عنها ضرورية لتكوين البلعمة الذاتية مطلوبة لعزل LDH.

كما يتضح ، تم إلغاء عزل LDH الناجم عن الجوع في ATG5 بالضربة القاضية MEFS. علاوة على ذلك ، يتم إضعافها أيضا في ATG7 و ATG9A بالضربة القاضية MEFs. أخيرا ، يتم تحديد تأثيرات إسكات RNAi بوساطة نسخ جينات ATG الرئيسية.

ينظر إلى التعدي باستخدام ATG9A الذي يستهدف siRNA أو مع الاستهداف المشترك ل ULK1 و ULK2 على أنه يقلل بشدة من عزل LDH في خلايا LNCaP. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تكون دقيقا في جميع خطوات سحب العينات. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل مقايسة تحلل البروتين طويل العمر من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت هناك تغييرات ملحوظة في نشاط العزل مما أدى إلى تغييرات مماثلة في نشاط التحلل الذاتي.

بعد إنشاء هذه الطريقة في خطوط خلايا الثدييات ، استخدمناها لإثبات أن الالتهام الذاتي السائب مستقل عن عائلة بروتين LC3 وبدلا من ذلك يتطلب GABARAPs. هذا يسلط الضوء على أهمية استخدام طرق LC3 المستقلة لمراقبة نشاط الالتهام الذاتي.