أجبر اللعاب كأسلوب لتحليل اختصاص البعوض ناقل
أغسطس 7, 2018
لكفاءة السيطرة على البعوض يوضع انتقال الفيروس، المعرفة بإمكانيات مكافحة ناقلات البعوض الحامل لكل منها أهمية خاصة. يصف لنا اللعاب القسري كوسيلة لتحليل المتجهات اختصاص Aedes albopictus وثلاثة من الأصناف Culex مختلفة لانتقال الفيروس Zika.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأمراض التي ينقلها البعوض ، مثل ما إذا كان نوع البعوض ناقلا منافسا لفيروس معين أم لا. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن تحليل كمية كبيرة من البعوض في وقت واحد ، دون استخدام المختبر مثل الفئران. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها تحتاج إلى مهارات حركية دقيقة لا يمكن اكتسابها إلا من خلال الممارسة.
يعدالعرض المرئي لهذه التقنية أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم الخطوات الرئيسية. إنها تتطلب خبرة في التعامل مع البعوض والفيروسات ، وكذلك المهارات الحركية الدقيقة. للبدء ، قم بتخفيف مخزون الفيروس. بعد ذلك ، امزج دم الإنسان منتهي الصلاحية مع الفركتوز ومصل الأبقار المفلتر ومخزون الفيروس.
قم بتجميد 140 ميكرولتر من مزيج دقيق الدم لمزيد من التحليل عبر TCID50. بعد ذلك ، ضع قطرتين سعة 50 ميكرولتر من مزيج دقيق الدم في قارورة بلاستيكية ، واترك البعوض يتغذى لمدة ساعتين. بعد تخدير البعوض ، عد الأفراد المصابين بالاحتقان الكامل ، وانقلهم إلى قارورة جديدة تحتوي على وسادة قطنية مبللة بالفركتوز.
ثم حافظ على البعوض عند 27 درجة مئوية و 80٪ رطوبة لمدة 14 أو 21 يوما. قم بتجديد ضمادات القطن المشبعة بالفركتوز كل 72 ساعة ب 1.5 مل من الفركتوز. أولا ، قم ببذور 20،000 خلية فيرو لكل بئر في صفيحة 96 بئرا مع وسط نمو مكمل.
لتحضير جهاز إفراز اللعاب ، ضع لوحا زجاجيا مربعا على المقعد بزاوية 30 درجة. ثم قم بلصق شريط على الوجهين بالجزء العلوي من اللوحة الزجاجية. بعد ذلك ، قم بلف طين النمذجة حتى يبلغ قطره 0.5 سم ، وقم بتثبيته على اللوحة أفقيا على بعد سنتيمتر واحد من الشريط على الوجهين.
قم بقص الأطراف من العدد المطلوب من أطراف المرشح سعة 10 ميكرولتر ، واملأ كل طرف ب 10 ميكرولتر من PBS. بعد ذلك ، ضع النصائح على طين النمذجة ، وقم بتثبيتها بضغط لطيف. بعد ذلك ، قم بشل حركة البعوض عن طريق إزالة أرجلهم وأجنحتهم.
ثبت البعوض على الشريط الموجود فوق أطراف المرشح. ضع خرطوم كل بعوضة برفق في طرف مرشح. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة أطراف المرشح ، وتخلص من الطين والشريط اللاصق.
انقل اللعاب الذي تم جمعه إلى أنابيب تفاعل تحتوي على 10 ميكرولتر من PBS. اخلطي اللعاب و PBS برفق ، وانقلي الخليط إلى آبار طبق 96 بئرا. احتضان اللوحة لمدة سبعة أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
باستخدام المجهر الضوئي ، تحقق من وجود الخلايا بحثا عن تأثير الاعتلال الخلوي. بمجرد أن يصبح البئر إيجابيا لتأثير الاعتلال الخلوي ، استخدم ماصة لحصاد 140 ميكرولترا من المادة الطافية. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب التفاعل.
بعد ذلك ، امزج 140 ميكرولترا من المادة الطافية مع 560 ميكرولتر من المخزن المؤقت AVL ، واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، أضف 560 ميكرولتر من الإيثانول ، واقلب العينة للخلط. وباستخدام هذا البروتوكول، تم اختبار العديد من أنواع البعوض للكشف عن عدوى فيروس زيكا وانتقاله في ظل ظروف مناخية مختلفة.
في ظل ظروف حضانة 27 درجة مئوية ، أظهرت جميع أنواع الزاعجة لعاب فيروس زيكا. على العكس من ذلك ، لم تحتوي أي من عينات اللعاب من أصناف Culex على دليل على الفيروس. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية ل 50 بعوضا في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب إفراز اللعاب القسري. لا تنس أن العمل مع البعوض المصاب يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذلك يجب دائما اتخاذ تدابير السلامة الخاصة للتعامل مع البعوض في ظل ظروف BSA-3 أثناء إجراء أي تجربة.
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة طريقة لتحليل الكفاءة الناقلة للبعوض، وتحديداً نوع Aedes albopictus وأصناف مختلفة من Culex، في نقل فيروس Zika. وتسمح تقنية التحفيز القسري على اللعاب بالتحليل المتزامن لبعوض متعدد دون الحاجة إلى استخدام حيوانات المختبر.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- بيولوجيا النواقل
- علم الفيروسات
- الأمراض المنقولة بالبعوض
خلفية علمية
- يعد فهم الكفاءة الناقلة أمراً بالغ الأهمية للسيطرة على الفيروسات التي ينقلها البعوض.
- يُعد التحفيز القسري على اللعاب طريقة حديثة لتقييم إمكانات النقل لدى البعوض.
- كانت الطرق السابقة تتطلب غالباً استخدام حيوانات مختبرية، وهي المشكلة التي تهدف هذه التقنية إلى القضاء عليها.
- تعتبر المهارات الحركية الدقيقة أساسية لهذه الطريقة، مما يستلزم التدريب والخبرة.
الغرض من الدراسة
- تقييم كفاءة النواقل لأنواع مختلفة من البعوض في نقل فيروس Zika.
- توضيح طريقة تسمح بإجراء تحليل عالي الإنتاجية للعاب البعوض.
- توفير دليل مرئي للباحثين الجدد على هذه التقنية.
الطرق المستخدمة
- تحضير خليط وجبة دمية لتغذية البعوض.
- تقنية التحفيز على اللعاب لجمع اللعاب من البعوض.
- طرق زراعة الخلايا لتقييم وجود فيروس Zika.
- حضن العينات وتحليلها للكشف عن التأثيرات المرضية الخلوية.
النتائج الرئيسية
- أظهرت أنواع Aedes لعاباً إيجابياً لفيروس Zika تحت ظروف خاضعة للرقابة.
- لم تظهر تصنيفات Culex أي دليل على وجود فيروس Zika في لعابها.
- تسمح هذه الطريقة بفحص ما يصل إلى 50 بعوضة في الساعة الواحدة بمجرد إتقانها.
- تساعد العروض التوضيحية المرئية بشكل كبير في تعلم هذه التقنية.
الاستنتاجات
- يُعد التحفيز القسري على اللعاب طريقة فعالة لدراسة انتقال الفيروسات التي ينقلها البعوض.
- يُعتبر التدريب والممارسة أمرين أساسيين للتطبيق الناجح لهذه التقنية.
- يجب الالتزام بتدابير السلامة عند التعامل مع البعوض المصاب.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح اختبارات اللعاب القسري تقييماً عالي الإنتاجية لكفاءة البعوض كناقل دون الحاجة إلى نماذج حيوانية، مما يدعم التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة من اكتشاف مضادات الفيروسات. توفر هذه الطريقة كشفاً كمياً للفيروسات القادرة على التكاثر من حشرات فردية، مما يوجه قرارات المضي قدماً أو التوقف بشأن المرشحات الوقائية أو العلاجية ضد الفيروسات المنقولة بالمفصليات (arboviruses). كما أن قابليتها للتوسع والتكرار تعزز الثقة التنبؤية في الحد من المخاطر قبل السريرية للتدخلات المانعة للانتقال.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس إمكانية انتقال الفيروس في ناقلات الأمراض الفردية.
- القيمة التشغيلية: تمكين الحد من المخاطر البيولوجية للأهداف من خلال التقييم المباشر لكفاءة الناقل في ظل ظروف مضبوطة.
- القيمة التنبؤية: دعم فرز المحافظ البحثية عن طريق تحديد أنواع النواقل غير الكفؤة، مما يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة في برامج الفيروسات المنقولة بالمفصليات (arbovirus).
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة بيولوجية تم التحقق من صحتها لعمليات الفحص المضاد للفيروسات اللاحقة من خلال تأكيد قابلية الإصابة بالفيروس في نماذج النواقل.
- القيمة التشغيلية: توحيد معايير جمع اللعاب والكشف عن الفيروس، مما يضمن مخرجات كمية قابلة للتكرار عبر مجموعات كبيرة من البعوض.
- القابلية للتوسع: تسهيل إعادة استخدام المنصة للتقييم عالي الإنتاجية للمركبات أو اللقاحات التي تمنع انتقال العدوى.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يتوافق مع الأنظمة ذات الصلة بالمرض من خلال اختبار كفاءة الناقل تحت درجات حرارة ذات صلة وبائياً (18–27°C).
- القيمة التشغيلية: يضمن الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري عبر قراءات فيروسية ثابتة تعتمد على اللعاب.
- تخفيف المخاطر: يوجه قرارات التطوير من خلال تحديد عتبات انتقال تعتمد على درجة الحرارة للمرشحين الرئيسيين.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج طريقة التحفيز القسري للعاب ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف مروراً بتحديد المركبات الرائدة وصولاً إلى التقييم قبل السريري، لا سيما بالنسبة للتدخلات الموجهة ضد الفيروسات المنقولة بالمفصليات (arboviruses).
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال قياس كمية وجود الفيروس في لعاب البعوض كمؤشر وظيفي لإمكانية الانتقال.
- الفحص: توفر جاهزية المقايسة وقابلية التكرار من خلال الجمع المعياري للعاب والكشف عن الفيروس بما يعادل TCID50 في خلايا Vero.
- التحليلات: تولد قياسات كمية للمتغيرات التابعة (عيار الفيروس في اللعاب) مما يتيح المقارنة عبر الأنواع والسلالات والظروف البيئية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الاستمرارية قبل السريرية عبر بيانات انتقال مصنفة حسب درجة الحرارة تعكس نوافذ الانتقال ذات الصلة بالميدان.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: تعمل كقدرة قابلة لإعادة الاستخدام لفحص العديد من الفيروسات المنقولة بالمفصليات (مثل ZIKV و DENV و CHIKV) عبر أنواع النواقل دون الحاجة إلى إعادة التحسين.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف، وتقليل الغموض الميكانيكي في بيولوجيا الانتقال.
- القيمة التشغيلية: التوحيد القياسي، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع عبر فرق علم الحشرات وعلم الفيروسات.
- القيمة الاستراتيجية: اتخاذ قرارات أفضل بشأن المضي قدماً أو التوقف، وكفاءة رأس المال، وتقليل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من برامج مضادات الفيروسات.
- تأثير المحفظة: تحديد الأولويات واتخاذ قرارات التطوير بناءً على بيانات تجريبية لكفاءة النواقل مع تعديل المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع البعوض، وعلم الفيروسات، وتقنيات الجراحة المجهرية تحت مستوى السلامة البيولوجية الثالث (BSL-3).
- يعتمد على أجهزة متخصصة تشمل أدوات تحفيز اللعاب، وحاضنات ذات تحكم دقيق في الرطوبة، والمجهر لتقدير التأثير المرضي الخلوي.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق البحثية فيما يخص تحضير وجبات الدم، والجداول الزمنية للحضن، وفترات جمع اللعاب.
- تشمل اعتبارات التكيف حجم الخرطوم الخاص بكل نوع، وسلوك التغذية، وشكل الغدة اللعابية عبر نماذج النواقل المختلفة.
- تشمل القيود العملية الحاجة إلى تدريب مكثف لتحقيق الكفاءة، واعتماد الطريقة على استعادة الفيروسات القابلة للحياة من اللعاب.
