تخصيب فوسفوبيبتيدي مقترنة بكمية خالية من تسمية الطيف الكتلي للتحقيق في فوسفوبروتيومي في سرطان البروستاتا

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أي مجال بحثي حيث تكون إشارة الفسفرة ذات أهمية مثل مجال السرطان لتقييم التغيرات في شبكات الإشارات بعد المقاومة العلاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحديد الآلاف من الفوسفوببتيدات بطريقة بسيطة نسبيا وغير مكلفة لتقييم الفوسفوبروتيوم عالميا. لحصاد أنسجة الورم ، قم بوزن الورم وفي أنبوب اختبار الاستزراع ، أضف ملليلترين من محلول تحلل الجليد البارد لكل 100 ملليغرام من الأنسجة.

ثم استخدم الخالط المحمول أو أعلى مقاعد البدلاء لتجانس المحللة. لتقليل العينة والكحول ، قم بتسخين الأنبوب على 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم قم بتبريد العينة على الثلج لمدة 15 دقيقة. بينما لا تزال على الجليد ، قم بصوتنة المحللة ثلاث مرات ، ثم قم بتسخين العينة عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ضع أنبوب صوتنة في دوار دلو متأرجح وقم بالطرد المركزي للمحللات عند 3 ، 500 جم و 15 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم اجمع المادة الطافية وتخلص من الحبيبات. لهضم المحللة ، استخدم 100 مللي مولار تريس لتخفيف العينة 12 ضعفا لتقليل كمية الجوانيدينيوم. للحصول على خمسة ملليغرامات من البروتين ، أضف 10 ميكروغرام من ليزيل إندوببتيداز أو lys-C واحتضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى ست ساعات.

تحضير مليغرام واحد لكل مليلتر من التربسين المعالج ب TPCK في مليمولار واحد من حمض الهيدروكلوريك مع 20 ملليمولار كلوريد الكالسيوم والتربسين المضاف بنسبة واحد إلى 100 تريبسين إلى البروتين. احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. ثم أضف كمية إضافية من التربسين إلى الأنبوب واحتضان العينة عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

أضف العينة إلى مرشح قطع 15 مليلتر 10 كيلودالتون. قم بالطرد المركزي للعينة في دلو متأرجح أو دوار ثابت الزاوية عند 3 و 500 جم و 15 درجة مئوية حتى يصبح حجم الاحتفاظ أقل من 250 ميكرولترا. ثم اجمع التدفق من خلال وتخلص من الاحتفاظ.

لتحمض العينة ، أضف ما يقرب من 20 ميكرولترا من 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك أو TFA لكل مليلتر من المحلل. امزج الأنبوب جيدا واستخدم شريط الأس الهيدروجيني لقياس الرقم الهيدروجيني. إذا لزم الأمر ، أضف 5٪ TFA إضافيا لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 2.5.

بعد ذلك ، قم بالاتصال بالطرف الأقصر من عمود C18 بمشعب فراغ. بعد ضبط الفراغ بين 17 و 34 كيلو باسكال ، استخدم ثلاثة ملليلتر من الأسيتونيتريل بنسبة 100٪ وماصة زجاجية لترطيب العمود. قم بموازنة العمود باستخدام ماصة زجاجية وتطبيق حصتين من ثلاثة مليلتر بنسبة 0.1٪ TFA.

ثم قم بتحميل العينة المحمضة على العمود. استخدم ثلاثة أحجام سعة ثلاثة مليلتر من 0.1 TFA لغسل العمود. ثم ضع ملليلترين من 40٪ ACN 0.1٪ TFA لتصفية العينة وجمع جزأين من المليلتر في أنابيب زراعة الزجاج.

باستخدام البارافيلم ، قم بتغطية أنابيب الإزالة واستخدم إبرة قياس 20 لثقب ثلاثة إلى خمسة ثقوب في الغطاء قبل تجميد العينات طوال الليل. أعد تعليق المسحوق المجفف بالتجميد مع 0.5 مل من الترسيب المناعي المثلج أو المخزن المؤقت لربط IP في كل جزء. انقل حجم إعادة التعليق 0.5 ملليلتر من الكسر الثاني إلى الأنبوب باستخدام الكسر الأول واحفظ طرف الماصة.

استخدم 0.5 مل أخرى من المخزن المؤقت IP لشطف كل أنبوب تجفيد قبل نقل المحتويات إلى أنبوب التبريد ، ثم كرر الشطف باستخدام ملليلترين من المخزن المؤقت IP. بعد استخدام P200 بطرف مقطوع لنقل مخزون 0.5 ملليغرام لكل مليلتر من ملاط حبة الأجسام المضادة إلى أنبوب الطرد الدقيق ، أضف 450 ميكرولترا من المخزن المؤقت المرتبط بعنوان IP البارد لغسل 50 ميكرولترا من ملاط حبة الأجسام المضادة 4G10 و 25 ميكرولترا من ملاط حبة الأجسام المضادة 27 B10.4 في أنبوب الطرد الدقيق. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 100 جم وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة.

بعد شفط المادة الطافية ، أضف حجما متساويا مثل الملاط الأصلي للمخزن المؤقت لربط IP لإعادة تعليق الخرز. أضف حبات pY المغسولة مسبقا إلى محلول العينة المعلق في الأنابيب المبردة للغطاء اللولبي ، ثم احتضنها عند أربع درجات مئوية على دوار من طرف إلى طرف طوال الليل. بعد تدوير الخرزات ، احفظ المادة الطافية التي سيتم استخدامها لإثراء الببتيدات pST.

بعد ذلك ، استخدم 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط IP لإعادة تعليق الخرزات ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر. قم بتدوير العينات عند 100 جم وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. ثم باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط IP ، اغسل الخرزات ثلاث مرات.

اغسل الخرزات أربع مرات ب 450 ميكرولتر من 25 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم ، الرقم الهيدروجيني 7.5. اغمس طرف تحميل الجل أسفل سطح الخرزة قليلا واستنشق المادة الطافية تماما. أضف أربعة أضعاف حجم الخرزة البالغ 0.1٪ TFA إلى الخرز.

ثم اخلطيهم جيدا واحتضان الأنبوب في خلاط حراري عند 1,000 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. انقل إعادة التعليق إلى مرشح دوران 0.2 ميكرومتر وقم بالطرد المركزي للمرشح عند 850 جم لمدة دقيقة واحدة. بعد نقل الشطف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين ، قم بتركيز المادة المزيلة بالتفريغ على الجفاف عند 40 درجة مئوية مع وقت تسخين 300 دقيقة بين عشية وضحاها.

لتحضير حبات أكسيد التيتانيوم الموجودة في الأطراف ، أضف 200 ميكرولتر من 100٪ ACN. ثم اقلبه ونفض الغبار عن الطرف الضيق لتحريك السائل نحو الغطاء. باستخدام شفرة حلاقة ، اقطع الطرف وضعه فوق أنبوب الربط منخفض البروتين.

ثم قم بإزالة الغطاء وأدخل ماصة دقيقة لإخراج ACN المتبقي قبل تكرار الغسيل. قم بتكييف ثاني أكسيد التيتانيوم مسبقا ب 500 ميكرولتر من 100٪ ACN مرتين. ثم قم بتكييف ثاني أكسيد التيتانيوم ب 500 ميكرولتر من 0.2 مولار من فوسفات الصوديوم المخزن الهيدروجيني 7 مرتين.

أخيرا ، استخدم 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوازن لغسل الخرزات ثلاث مرات. أضف 400 ميكرولتر من 50٪ ACN 0.1٪ TFA إلى أنبوب الربط منخفض البروتين. ثم أضف 84 ميكرولتر من حمض اللاكتيك.

انقل الفوسفوربتيدات المعلقة إلى أنبوب الربط منخفض البروتين واحتضانها في درجة حرارة الغرفة باستخدام دوار من طرف إلى طرف لمدة ساعة واحدة. بعد تكوير الخرزات ، استخدم 300 ميكرولتر من مخزن التوازن لغسلها مرتين وتدويرها. باستخدام 300 ميكرولتر من مخزن الشطف المؤقت ، اشطف الخرز مرتين.

ثم انقلها إلى مرشح دوران 0.2 ميكرومتر. بعد الغزل ، انقل وحدة المرشح إلى أنبوب ربط نظيف منخفض البروتين سعة 1.5 ملليلتر ومع 200 ميكرولتر من 0.9٪ أمونيوم في الماء ، قم بإزالة المحتويات مرتين. بعد فحص درجة الحموضة ، قم بتركيز المادة المزيلة بالمكنسة الكهربائية للجفاف طوال الليل لتبخر الأمونيا.

لتحلية الببتيدات لتحليل MS ، أعد تكوين الفوسبوبتيدات ب 15 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. نظف العينة باستخدام طرف C18 بسعة ربط تبلغ خمسة ميكروغرامات واتبع بروتوكول الشركة المصنعة. أخيرا ، بعد تجفيف حجم الشطف تماما عن طريق تركيز الفراغ ، قم بإعادة تعليق الفوسفوربتيدات المجففة في 12.5 ميكرولتر من محلول قياس الطيف الكتلي.

يؤكد هذا الجل الملون بالكوماسي من المحللة المهضومة مسبقا وجود البروتينات بينما يؤكد تلطيخ المحللة بعد الهضم الهضم الكامل. من أجل الهضم الكامل ، يجب ألا تظهر أي نطاقات أعلى من 15 كيلودالتون باستثناء نطاقي 30 كيلودالتون و 23.3 كيلودالتون ل lys-C و trypsin على التوالي. تقلل إضافة lys-C أيضا من عدد الانقسامات المفقودة.

يفصل الترسيب المناعي pY بشكل فعال pY عن ببتيدات pST في المتوسط 85٪ من الفوسبوبتيدات المحددة من مستحضر pY هي pY وأكثر من 99٪ من الفوسفوببتيدات المحددة من مستحضر pST هي pST. يستخدم ثاني أكسيد التيتانيوم لإثراء الفوسفوروببتيدات في كلا المستحضرين. تتراوح النسبة المئوية المتوقعة من الببتيدات في المستحضر الجاهز لمرض التصلب العصبي المتعدد التي يتم فسفرها بين 30 إلى 50٪ وغالبية الفوسفوريبتيدات المكتشفة لها مجموعة فوسفوريل واحدة أو مزدوجة.

بعد إجراء قياس الطيف الكتلي ، يتم تحميل ملفات MS الأولية في برنامج تحليل MS. كما هو موضح هنا ، فإن تعيين قطع احتمالية توطين أكبر من 0.75 يقوم بتصفية ما يقرب من 5٪ من ببتيدات pY و 15٪ و 34٪ من ببتيدات pS و pT على التوالي. بعد تطبيق هذه المرشحات ، يبلغ العدد المتوقع لتعريفات الفوسفوببتيد في نهاية تحليل MS حوالي 300 ببتيدات PY لخمسة ملليغرامات من البروتين الأولي وحوالي 7،500 ببتيدات pS و 640 ببتيدات pT ل 2.5 ملليغرام من كمية الببتيد الأولية من مستحضرات التخصيب المعنية.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ستة أيام إذا تم تنفيذ خطوات pY و pST بالتوازي. ومع ذلك ، بالنسبة لأكثر من ثماني عينات ، قم بتنفيذ الخطوات بالتسلسل لتقليل الخطأ الفني على مدار أربعة أيام إضافية. أثناء محاولة هذه الإجراءات ، من المهم أن تتذكر التركيز على التفاصيل.

كل خطوة مهمة ويمكن أن تؤثر على جودة الاستعدادات النهائية بما في ذلك ضوابط الجودة اللازمة أمر بالغ الأهمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج البروتينات وهضمها ، متبوعا بتخصيب الفوسفوببتيد للتحليل عبر قياس الطيف الكتلي للتحقيق في التغيرات العالمية في الفوسفوبروتين.