تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس
September 30th, 2018
يصف لنا طريقة لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة، تليها تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة. يسمح هذا الأسلوب بتحليل التنمية النسب الغدد الصماء في البنكرياس، خلية ديناميات عدم التجانس وترانسكريبتوميك.
يمكن أن يكون هذا الأسلوب الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حقل جزيرة البنكرياس حول تمايز نسب الجزر البنكرياسية, النضج, والتجدد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لجمع خلايا الجزر البنكرياسية واحدة لتوليد عالية الجودة خلية واحدة RNA تسلسل البيانات. تطبيق هذه التقنية تمتد نحو علاج مرض السكري وغيرها من الأمراض المرتبطة الغدد الصماء البنكرياس من خلال تحليل النسخ للخلايا الغدد الصماء البنكرياس واحد على الظروف المرضية.
مظاهرة بصرية من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما يمكن أن يكون إدخال الإبرة في القناة الصفراوية الضيقة من البنكرياس لضخ الضخ صعبة. لليوم الجنيني 17.5 أجنة. بعد فتح تجويف البطن، واستخدام ملاقط الكوع لنقل الأنسجة الحشوية إلى طبق أسفل أسود ستة سنتيمترات تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.
استخدم ملقط لفصل البنكرياس عن الأنسجة الحشوية. ووضع أنسجة البنكرياس في قارورة 20 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلترات من محلول الكولاجيناز البارد. بالنسبة ليوم ما بعد الولادة صفر إلى 15 فأرًا ، قم بتشريح جميع فصوص البنكرياس بعناية قبل وضع الأنسجة في الكولاجيناز.
بالنسبة ليوم ما بعد الولادة من 18 إلى 60 فأرًا ، قم أولاً بإزالة الـ xiphoid واستخرج الأمعاء إلى الجانب الأيمن من تجويف البطن. دفع الفصوص الوسطية اليسرى والأينية للكبد إلى كل جانب لفضح المرارة والقناة الصفراوية المشتركة. ومشبك الاثني مع زوج من المشابك السفينة الصغيرة في المواقف العليا والسفلى لجناح الموقع حيث القناة الصفراوية يدخل الاثنيثان.
بعد ذلك، قم بتحميل حقنة 5 ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 30 مع محلول الكولاجيناز البارد. واستخدم المجهر لإدخال طرف الإبرة في المرارة. بعناية وسلاسة التعامل مع الإبرة من خلال القناة الصفراوية المشتركة.
والاكتئاب المكبس لضخ البنكرياس مع 1-5 ملليلتر من الحل الكولاجيناز وفقا لحجم الماوس. عندما تم perfused كل من الحل، واستخدام ملقط لنقل البنكرياس على الفور إلى قارورة 20 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من محلول الكولاجيناز الباردة الطازجة. عندما يتم جمع جميع أنسجة البنكرياس، ضع القارورة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق، تليها ثلاث إلى خمس دقائق من الاهتزاز اللطيف.
ثم تصفية المنتج المهضم من خلال مصفاة نايلون 0.25 ملليمتر في أنبوب جديد من أجهزة الطرد المركزي 50 ملليلتر. واستخدم حقنة 20 ملليلتر تحتوي على الثلج البارد PBS لغسل مصفاة جيدا. لليوم ما بعد الولادة 18 إلى 60 pancreata، الطرد المركزي العينة المصفاة وإعادة تعليق الأنسجة في 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
ثم decant تعليق الأنسجة في طبق أسفل أسود ستة سنتيمترات، واستخدام ماصة 200 ميكرولتر والمجهر تشريح لاختيار الجزر لنقلها إلى أنبوب microcenter 1.5 ملليلتر التي تحتوي على حجم صغير من برنامج تلفزيوني الباردة. ليوم الجنينية 17.5 بعد الولادة يوم 15 pancreata, الطرد المركزي أنسجة البنكرياس المصفاة وإعادة تعليق بيليه في محلول تريبسين-EDTA لاحتضان أربع دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، حاول بلطف تقييم بيليه لمدة دقيقة واحدة مع ماصة 200 ميكرولتر ، تليها إضافة 0.5 مرة حجم مصل البقرة الجنينية الباردة مع دوامة لطيف لوقف الهضم.
ثم جمع خلاصة عن طريق الطرد المركزي و resuspend الخلايا في 200 ميكرولترات من المخزن المؤقت FACS في أنبوب FACS 5 ملليلتر للفرز عن طريق تدفق الخلايا. لقطف خلية واحدة وتحلل، aliquot أعدت حديثا العازلة خلية تحلل في ثمانية أنابيب PCR الشريط، ونقل خلية واحدة في كل. دوامة العينات لlyse الخلايا لإطلاق الجيش الملكي النيبالي، تليها الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية، والتخزين الفوري على الجليد.
للنسخ العكسي، احتضان ال ليسات لمدة ثلاث دقائق في 72 درجة مئوية تليها دقيقة واحدة على الجليد. لفترة وجيزة الطرد المركزي العينات لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية وإضافة 5.7 ميكرولترات من مزيج النسخ العكسي إلى كل عينة ليصل الحجم الإجمالي إلى 10 ميكرولترات لكل عينة. بعد دوامة لطيف والطرد المركزي، تحميل العينات في ثيرسيكلر والبدء في برنامج النسخ العكسي.
بالنسبة لـ البوليميراز المتسلسل، أو PCR، أضف 15 ميكرولترات من مزيج PCR إلى كل عينة تحتوي على ردود الفعل الأولى، تليها دوامة لطيف والطرد المركزي. ثم تحميل العينات في thermocycler وبدء تشغيل برنامج PCR. لتنقية PCR، إضافة 25 ميكرولترات من حبات تنقية الحمض النووي resuspended إلى كل عينة، ومزيج جيد من خلال دوامة.
ثم تدور بسرعة العينات في درجة حرارة الغرفة لجمع السائل مع تجنب تسوية الخرز. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ضع العينات على حامل مغناطيسي مناسب، وإزالة بعناية والتخلص من المابير عندما يكون الحل واضحًا. غسل الخرز مع اثنين من 30 ثانية يغسل في 200 ميكرولتر من الطازجة أعدت 80٪ الإيثانول لكل غسل.
والتخلص من الإيثانول المتبقي بعد الغسيل الثاني. عندما يكون الخرز قد جفت الهواء، إضافة 11 ميكرولترات من المياه الخالية من النوى ل elute هدف الحمض النووي من الخرز، تليها دوامة. ثم بسرعة الطرد المركزي العينات، والعودة العينات إلى موقف مغناطيسي حتى الحل واضح ونقل 10 ميكرولترات من كل عينة إلى أنبوب PCR جديد.
وينبغي أن يكون لـ cDNA المكبرة بنجاح طول كامل فوق 500 زوج أساسي، وأن يثري من 1.5 إلى 2 كيلو من أزواج القاعدة. وعلاوة على ذلك، هناك عادة 500 إلى 600 إثراء زوج قاعدة من cDNA لوحظ في الأنسولين واحد RFP بالإضافة إلى الخلايا، والتي قد تمثل نصوص الأنسولين. ومع ذلك، فإن شظايا cDNA بالقرب من 100 زوج أساسي هي خافضات التمهيدي، والتي عادة ما تكون ناجمة عن التمهيديات الزائدة والتي يجب إزالتها عن طريق تكرار خطوة تنقية الحمض النووي.
عادةً ما تمثل أجزاء cDNA بين أزواج قاعدة 100 و500 cDNA المتدهورة، والتي تسببها حالة الخلية أو مشاكل المنطقة السيئة، مثل التلوث RNase وينبغي استبعاد. بعد تنقية مكتبات cDNA للتسلسل ، يمكن الحصول على cDNA تتراوح بين 250 إلى 450 زوجًا أساسيًا من خلال إضافة حبات تنقية الحمض النووي إلى الجولتين الأولى والثانية من التنقية. بعد تنقية حبة الحمض النووي، يجب أن تكون نقاط جودة التسلسل أكبر من 30 خلال تقييم جودة التسلسل.
للحصول على خلايا عالية الجودة لتحليلات المصب ، يتم استبعاد الخلايا التي يقل عددها عن 0.5 مليون قراءة أو مع أقل من 4000 جين تم اكتشافها ، مما يسهل توصيف مجموعات مختلفة من الخلايا وتحديد الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل غير متجانس في مجموعات مختلفة بعد تحليل المكونات الرئيسية والتجميع الهرمي. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تضخ البنكرياس بسرعة قبل هضم الكولاجين لتجنب الجزر على الهضم والحفاظ على البيئة الحرة RNase أثناء إجراءات الخلية الواحدة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التصوير الجزري والثقافة لتسهيل التصور من هيكل جزيرة ودراسة الاستجابات الخلوية وتحفيز المخدرات.
بعد التطوير، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث البنكرياس لاستكشاف آليات تطوير سلالة الجزر وتجديدها، فضلا عن تطور مرض السكري في الثدييات.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لعزل الخلايا الصماء من مراحل مختلفة من تطور البنكرياس، متبوعًا بتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. تُمكّن هذه التقنية من تحليل مفصل لتطور نسالة الخلايا الصماء البنكرياسية وتنوع الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم الغدد الصماء
الخلفية
- فهم تمايز نسالة جزر البنكرياس مهم لأبحاث السكري.
- تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية يوفر بيانات نقل الحمض النووي عالية الجودة.
- تسمح الطريقة بدراسة نضج الخلايا وتجديدها.
- التوجيه البصري مهم للجوانب التقنية للإجراء.
غرض الدراسة
- لتحليل تطور الخلايا الصماء البنكرياسية وتنوعها.
- للتحقيق في عمليات التجديد في جزر البنكرياس.
- لتعزيز فهم السكري والأمراض ذات الصلة من خلال تحليل نقل الحمض النووي الريبي.
الطرق المستخدمة
- عزل الخلايا الصماء البنكرياسية من البنكرياس الجنيني، المواليد، وما بعد الولادة.
- تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحليل نقل الحمض النووي الريبي.
- تبرهن بصري على الطريقة للوضوح.
- استخدام الملقط المرفق و PBS البارد أثناء الإجراء.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في عزل خلايا جزيرة البنكرياس المفردة.
- يتم توليد بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي عالية الجودة.
- يتم توفير رؤى حول تمايز نسالة جزيرة البنكرياس ونضجها.
- يتم مناقشة التطبيقات المحتملة في علاج السكري.
الاستنتاجات
- تعتبر هذه التقنية أداة قيّمة لدراسة الخلايا الصماء البنكرياسية.
- تقدم مسارًا لفهم وعلاج أمراض الغدد الصماء البنكرياسية بشكل أفضل.
- يمكن أن يقوم البحث الإضافي على النتائج لاستكشاف خيارات العلاج.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomic profiling of pancreatic endocrine cells enables mechanistic de-risking in diabetes target validation by resolving cellular heterogeneity and lineage trajectories. This approach supports predictive confidence in early discovery by linking molecular phenotypes to functional states of insulin-producing β cells across developmental stages. The method provides a disease-relevant system for assessing target engagement and transcriptional responses in preclinical models of metabolic disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping endocrine progenitor differentiation and β cell maturation pathways.
- Operational Value: Provides quantitative single-cell resolution for de-risking targets involved in islet lineage specification and regeneration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-quality transcriptomic datasets for biomarker discovery and assay standardization in endocrine cell populations.
- Operational Value: Supports scalable isolation workflows for preparing validated cellular inputs in downstream screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by comparing transcriptional states across embryonic, neonatal, and postnatal pancreatic contexts.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cell state transitions to inform risk-adjusted advancement in preclinical diabetes models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing transcriptional readouts that inform target validation and lead identification in metabolic disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in endocrine lineage development and β cell functional maturation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative single-cell outputs for assay readiness and compound effect profiling in islet-derived systems.
- Analytics: Enables principal component analysis and hierarchical clustering to identify heterogeneously expressed genes and define cell states.
- Translational Research: Connects developmental transcriptional signatures to postnatal maturation and regeneration processes relevant to disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for endocrine cell profiling applicable across multiple disease stages and genetic models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic de-risking of β cell identity and function targets.
- Operational Value: Standardized isolation and sequencing workflow ensuring reproducibility across developmental timepoints.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing ambiguity in target biology and cellular response predictions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on transcriptional evidence in disease-relevant endocrine cell contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic perfusion, and single-cell handling under RNase-free conditions.
- Dependent on access to perfusion instrumentation, flow cytometry, and thermocycling platforms for library preparation.
- Necessitates cross-team standardization of digestion timing, staining protocols, and QC thresholds for cell viability and RNA integrity.
- Adaptation across model systems requires optimization of collagenase concentration and perfusion volume based on pancreatic size and developmental stage.
- Practical limitations include tissue yield variability and the need for rapid perfusion to prevent over-digestion, as noted in the procedural guidance.
