تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس

يمكن أن يكون هذا الأسلوب الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حقل جزيرة البنكرياس حول تمايز نسب الجزر البنكرياسية, النضج, والتجدد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لجمع خلايا الجزر البنكرياسية واحدة لتوليد عالية الجودة خلية واحدة RNA تسلسل البيانات. تطبيق هذه التقنية تمتد نحو علاج مرض السكري وغيرها من الأمراض المرتبطة الغدد الصماء البنكرياس من خلال تحليل النسخ للخلايا الغدد الصماء البنكرياس واحد على الظروف المرضية.

مظاهرة بصرية من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما يمكن أن يكون إدخال الإبرة في القناة الصفراوية الضيقة من البنكرياس لضخ الضخ صعبة. لليوم الجنيني 17.5 أجنة. بعد فتح تجويف البطن، واستخدام ملاقط الكوع لنقل الأنسجة الحشوية إلى طبق أسفل أسود ستة سنتيمترات تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.

استخدم ملقط لفصل البنكرياس عن الأنسجة الحشوية. ووضع أنسجة البنكرياس في قارورة 20 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلترات من محلول الكولاجيناز البارد. بالنسبة ليوم ما بعد الولادة صفر إلى 15 فأرًا ، قم بتشريح جميع فصوص البنكرياس بعناية قبل وضع الأنسجة في الكولاجيناز.

بالنسبة ليوم ما بعد الولادة من 18 إلى 60 فأرًا ، قم أولاً بإزالة الـ xiphoid واستخرج الأمعاء إلى الجانب الأيمن من تجويف البطن. دفع الفصوص الوسطية اليسرى والأينية للكبد إلى كل جانب لفضح المرارة والقناة الصفراوية المشتركة. ومشبك الاثني مع زوج من المشابك السفينة الصغيرة في المواقف العليا والسفلى لجناح الموقع حيث القناة الصفراوية يدخل الاثنيثان.

بعد ذلك، قم بتحميل حقنة 5 ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 30 مع محلول الكولاجيناز البارد. واستخدم المجهر لإدخال طرف الإبرة في المرارة. بعناية وسلاسة التعامل مع الإبرة من خلال القناة الصفراوية المشتركة.

والاكتئاب المكبس لضخ البنكرياس مع 1-5 ملليلتر من الحل الكولاجيناز وفقا لحجم الماوس. عندما تم perfused كل من الحل، واستخدام ملقط لنقل البنكرياس على الفور إلى قارورة 20 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من محلول الكولاجيناز الباردة الطازجة. عندما يتم جمع جميع أنسجة البنكرياس، ضع القارورة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق، تليها ثلاث إلى خمس دقائق من الاهتزاز اللطيف.

ثم تصفية المنتج المهضم من خلال مصفاة نايلون 0.25 ملليمتر في أنبوب جديد من أجهزة الطرد المركزي 50 ملليلتر. واستخدم حقنة 20 ملليلتر تحتوي على الثلج البارد PBS لغسل مصفاة جيدا. لليوم ما بعد الولادة 18 إلى 60 pancreata، الطرد المركزي العينة المصفاة وإعادة تعليق الأنسجة في 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة.

ثم decant تعليق الأنسجة في طبق أسفل أسود ستة سنتيمترات، واستخدام ماصة 200 ميكرولتر والمجهر تشريح لاختيار الجزر لنقلها إلى أنبوب microcenter 1.5 ملليلتر التي تحتوي على حجم صغير من برنامج تلفزيوني الباردة. ليوم الجنينية 17.5 بعد الولادة يوم 15 pancreata, الطرد المركزي أنسجة البنكرياس المصفاة وإعادة تعليق بيليه في محلول تريبسين-EDTA لاحتضان أربع دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، حاول بلطف تقييم بيليه لمدة دقيقة واحدة مع ماصة 200 ميكرولتر ، تليها إضافة 0.5 مرة حجم مصل البقرة الجنينية الباردة مع دوامة لطيف لوقف الهضم.

ثم جمع خلاصة عن طريق الطرد المركزي و resuspend الخلايا في 200 ميكرولترات من المخزن المؤقت FACS في أنبوب FACS 5 ملليلتر للفرز عن طريق تدفق الخلايا. لقطف خلية واحدة وتحلل، aliquot أعدت حديثا العازلة خلية تحلل في ثمانية أنابيب PCR الشريط، ونقل خلية واحدة في كل. دوامة العينات لlyse الخلايا لإطلاق الجيش الملكي النيبالي، تليها الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية، والتخزين الفوري على الجليد.

للنسخ العكسي، احتضان ال ليسات لمدة ثلاث دقائق في 72 درجة مئوية تليها دقيقة واحدة على الجليد. لفترة وجيزة الطرد المركزي العينات لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية وإضافة 5.7 ميكرولترات من مزيج النسخ العكسي إلى كل عينة ليصل الحجم الإجمالي إلى 10 ميكرولترات لكل عينة. بعد دوامة لطيف والطرد المركزي، تحميل العينات في ثيرسيكلر والبدء في برنامج النسخ العكسي.

بالنسبة لـ البوليميراز المتسلسل، أو PCR، أضف 15 ميكرولترات من مزيج PCR إلى كل عينة تحتوي على ردود الفعل الأولى، تليها دوامة لطيف والطرد المركزي. ثم تحميل العينات في thermocycler وبدء تشغيل برنامج PCR. لتنقية PCR، إضافة 25 ميكرولترات من حبات تنقية الحمض النووي resuspended إلى كل عينة، ومزيج جيد من خلال دوامة.

ثم تدور بسرعة العينات في درجة حرارة الغرفة لجمع السائل مع تجنب تسوية الخرز. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ضع العينات على حامل مغناطيسي مناسب، وإزالة بعناية والتخلص من المابير عندما يكون الحل واضحًا. غسل الخرز مع اثنين من 30 ثانية يغسل في 200 ميكرولتر من الطازجة أعدت 80٪ الإيثانول لكل غسل.

والتخلص من الإيثانول المتبقي بعد الغسيل الثاني. عندما يكون الخرز قد جفت الهواء، إضافة 11 ميكرولترات من المياه الخالية من النوى ل elute هدف الحمض النووي من الخرز، تليها دوامة. ثم بسرعة الطرد المركزي العينات، والعودة العينات إلى موقف مغناطيسي حتى الحل واضح ونقل 10 ميكرولترات من كل عينة إلى أنبوب PCR جديد.

وينبغي أن يكون لـ cDNA المكبرة بنجاح طول كامل فوق 500 زوج أساسي، وأن يثري من 1.5 إلى 2 كيلو من أزواج القاعدة. وعلاوة على ذلك، هناك عادة 500 إلى 600 إثراء زوج قاعدة من cDNA لوحظ في الأنسولين واحد RFP بالإضافة إلى الخلايا، والتي قد تمثل نصوص الأنسولين. ومع ذلك، فإن شظايا cDNA بالقرب من 100 زوج أساسي هي خافضات التمهيدي، والتي عادة ما تكون ناجمة عن التمهيديات الزائدة والتي يجب إزالتها عن طريق تكرار خطوة تنقية الحمض النووي.

عادةً ما تمثل أجزاء cDNA بين أزواج قاعدة 100 و500 cDNA المتدهورة، والتي تسببها حالة الخلية أو مشاكل المنطقة السيئة، مثل التلوث RNase وينبغي استبعاد. بعد تنقية مكتبات cDNA للتسلسل ، يمكن الحصول على cDNA تتراوح بين 250 إلى 450 زوجًا أساسيًا من خلال إضافة حبات تنقية الحمض النووي إلى الجولتين الأولى والثانية من التنقية. بعد تنقية حبة الحمض النووي، يجب أن تكون نقاط جودة التسلسل أكبر من 30 خلال تقييم جودة التسلسل.

للحصول على خلايا عالية الجودة لتحليلات المصب ، يتم استبعاد الخلايا التي يقل عددها عن 0.5 مليون قراءة أو مع أقل من 4000 جين تم اكتشافها ، مما يسهل توصيف مجموعات مختلفة من الخلايا وتحديد الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل غير متجانس في مجموعات مختلفة بعد تحليل المكونات الرئيسية والتجميع الهرمي. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تضخ البنكرياس بسرعة قبل هضم الكولاجين لتجنب الجزر على الهضم والحفاظ على البيئة الحرة RNase أثناء إجراءات الخلية الواحدة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التصوير الجزري والثقافة لتسهيل التصور من هيكل جزيرة ودراسة الاستجابات الخلوية وتحفيز المخدرات.

بعد التطوير، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث البنكرياس لاستكشاف آليات تطوير سلالة الجزر وتجديدها، فضلا عن تطور مرض السكري في الثدييات.