استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

يمكن أن تساعد هذه الطريقة عند إجراء تشخيصات نقطة الرعاية للمرضى الذين يعانون من علامات الالتهابات الفيروسية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراؤها بدون معدات مختبرية وكهرباء ، وبالتالي يمكن إجراؤها في جناح المستشفى. يوضح إجراء جمع الدم ، الطبيب أندرس فومسجارد ، والعالم مورتن راسموسن ، وكلاهما من مختبري.

ابدأ بإعداد أنابيب جمع الدم. استخدم إبرة قياس 25 بوصة متصلة بحقنة 3 مل ، لحقن 1.6 مل من عازلة التحلل التجارية في أنبوب مفرغ EDTA سعة 4 مل. من الأهمية بمكان الحفاظ على الفراغ في أنبوب جمع الدم لجمع الدم.

ومن ثم ، استخدم دائما إبرة لحقن المخزن المؤقت للتحلل في أنبوب جمع الدم. بعد ذلك ، أعد تعليق حجم 960 ميكرو لتر من جزيئات الزجاج المغناطيسي ، أو MGPs ، ونقله إلى أنبوب 1.8 مل مسمى. بعد ذلك ، قم بإدخال 4 مل من مخزن الغسيل المؤقت في أنبوب سعة 4.5 مل يحمل علامة WB-1.1.5ML من مخزن الغسيل الثاني في أنبوب سعة 3.6 مل يسمى WB-2 ، و 3 مل من مخزن الغسيل الثالث في أنبوب 4.5 مل يسمى WB-3.

أخيرا ، أضف 100 ميكرو لتر من محلول الشطف إلى أنبوب سعة 1.8 مل يحمل علامة EB ، واترك الأنابيب في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. لجمع الدم الكامل عن طريق الوريد من المريض ، استخدم إبرة فراشة مع أنبوب تمديد صغير للتجويف ، وأحد الأنابيب المفرغة لجمع الدم المعدة مسبقا والتي تحتوي على عازلة التحلل. ضع ذراع المريض في وضع هبوطي.

أدخل إبرة الفراشة في وريد المريض ، وقم بتوصيل أنبوب تفريغ جمع الدم بامتداد التجويف الصغير. بعد جمع الدم ، امزج محتويات الأنبوب عن طريق قلب الأنبوب من خمس إلى عشر مرات. تطهير الجزء الخارجي من الأنبوب باستخدام 70٪ من الإيثانول.

ثم احتضان الأنابيب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتعطيل الفيروس. لتنقية الأحماض النووية من الدم الذي تم جمعه ، امزج محتويات الأنبوب مرة أخرى عن طريق قلب الأنبوب المفرغ يدويا من خمس إلى عشر مرات. صب الكمية المحضرة من MGP مباشرة في أنبوب جمع الدم.

ضع غطاءا جديدا من أنبوب جمع الدم غير المستخدم على الأنبوب الذي يحتوي على العينة. ضع إصبعا على الغطاء للتأكد من إغلاق الأنبوب بإحكام ، واخلط محتويات الأنبوب عن طريق التقليب من خمس إلى عشر مرات. ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي واحتفظ بإصبعك على الغطاء لضمان إغلاق الأنبوب بإحكام.

ثم اقلب الحامل المغناطيسي بالأنبوب عدة مرات لتفريق MGP قبل أن يتجمع على جانب الأنبوب باستخدام المغناطيس. قم بإزالة غطاء الأنبوب ، وتخلص من محتويات الأنبوب في أنبوب تجميع سعة 50 مل ، باستخدام ماصة يمكن التخلص منها. صب الكمية المحضرة من WB-1 مباشرة في أنبوب جمع الدم وأغلق الغطاء على الأنبوب.

امزج المحتوى يدويا من خمس إلى عشر مرات. ثم اجمع الخرزات على جانب الأنبوب باستخدام المغناطيس وقم بإزالة السائل كما كان من قبل. أعد تعليق الخرزات في الحصة المعدة ل WB-2 ، ثم تخلص من المحلول ، وكرر الإجراء مع حصة معدة من WB-3.

أخيرا ، قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي وصب الكمية المحضرة من EB مباشرة في أنبوب جمع الدم. ضع الغطاء على الأنبوب ، وأعد تعليق MGP عن طريق النقر من خمس إلى عشر مرات بإصبع. أخيرا ، استخدم ماصة يمكن التخلص منها سعة 1.5 مل لنقل قطرة واحدة من MGP المعاد تعليقها إلى مزيج تفاعل تضخيم الحمض النووي النهائي.

تأكد من إعادة تعليق MGP بالكامل قبل نقل قطرة واحدة فقط إلى تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لإثبات المفهوم ، تم رفع الدم الكامل السلبي ب 10 أضعاف من معيار فيروس الإيبولا ، الذي تم إعداده من التفشي الأخير في جنوب غينيا ، أو ثلاثة تركيزات مختلفة من فيروس إبشتاين بار. تم تحليل الأحماض النووية المستخرجة بواسطة R2 qPCR أو qPCR الخاص بالفيروس الداخلي.

كلما انخفضت عتبة العبور ، أو CT ، زاد رقم نسخة الجينوم الفيروسي. هنا ، تم اكتشاف دماء كاملة بتركيزات مختلفة من فيروس الإيبولا بواسطة مصباح خاص بفيروس الإيبولا. يظهر التركيز النهائي للفيروس في عينة الدم الكامل المسننة على المحور X ، وتظهر الدقائق الإيجابية على المحور Y.

هنا ، تم رفع الدم الكامل مع 10 أضعاف من عينة مصل التهاب الكبد C المعيارية لمنظمة الصحة العالمية ، مع الكشف عن طريق RT qPCR الخاص بفيروس التهاب الكبد C. أخيرا ، تظهر هذه الصورة نتائج تفاعل مصباح خاص بفيروس إبشتاين بار ، على الدم الكامل الإيجابي لفيروس إبشتاين بار. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام المخزن المؤقت المحدد لربط التحلل.

هذه خطوة حاسمة ، وإعادة عامل حاسم للطريقة. سيؤدي هذا المخزن المؤقت لربط التحلل إلى تعطيل الفيروس في العينة. باتباع هذه التقنية ، يمكنك إجراء طرق مختلفة للكشف الجزيئي مثل المصباح و PCR ، وبالتالي يمكنك إجراء تشخيص تفريقي.