Benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني، إعادة تشكيل ومقايسة من بوليهيستيديني معلم متالونزيمي للمختبرات الجامعية

تسمح هذه الطريقة للطلاب الجامعيين بتنقية الإنزيمات المعدنية المرتبطة بالحديد بسرعة ثم استخدام هذا البروتين للإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الهيكل والوظيفة ، كل ذلك داخل حدود المختبر التعليمي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتطبيق على الإنزيمات غير المرتبطة بالحديد الهيم. يمكن الوصول إليه من قبل الطلاب الجامعيين ، ويتم تنفيذه بسهولة في مختبر التدريس.

لبدء هذا الإجراء ، احصل على عمود 1.5 × 20 سم مزود بمخرج قفل لور ، وغطاء علوي يحتوي أيضا على تركيب قفل لور ، ودعامة سرير سفلية للاحتفاظ بجزيئات الراتنج. قم بتركيب قفل اللور السفلي مع محبس للتحكم في التدفق. بعد ذلك ، احصل على زجاجة تحتوي على ملاط بنسبة 50٪ من راتنج حمض النتريلوأسيتيك المرتبط بالنيكل في 20٪ من الإيثانول الذي تم تخزينه مسبقا عند أربع درجات مئوية.

حرك الزجاجة برفق لإعادة تعليق الراتنج بالتساوي. من خلال العمل في درجة حرارة الغرفة ، استخدم ماصة متدرجة لسحب ملليمترين من الملاط ونقله إلى العمود. بعد تصريف محلول التخزين الزائد من الراتنج، استخدم ماصة باستور لإضافة 30 مل على الأقل من المخزن المؤقت لربط التحلل المبرد بعناية، مع التأكد من عدم إزعاج سطح الراتنج.

قم بتشغيل المخزن المؤقت أسفل جدران العمود لمنع تناثره. قم بموازنة الراتنج عن طريق السماح للمخزن المؤقت بالتصريف ببطء من العمود عن طريق الجاذبية إلى دورق التجميع. للبدء ، قم بإعداد عمود النيكل NTA لإضافة المستخلصات الخام الخالية من الخلايا عن طريق فتح محبس والسماح للمخزن المؤقت المتبقي لربط التحلل بالتصريف عن طريق الجاذبية من خلال راتنج النيكل NTA.

عندما يتم تصريف المخزن المؤقت تماما وينكشف سطح الراتنج ، أغلق المحبس. بعد ذلك، استخدم ماصة باستور لسحب المستخلصات الخام الخالية من الخلايا بعناية على الراتنج، مع الحرص على عدم إزعاج السطح. قم بتشغيل المستخلصات الخام أسفل جدار العمود لتجنب تناثرها.

بعد نقل جميع المستخلصات الخام إلى العمود ، افتح محبس حتى يتمكن العمود من التصريف عن طريق الجاذبية. اجمع 100 ميكرولتر من التدفق لتحليله لاحقا. استخدم طولا قصيرا من الأنابيب البلاستيكية لتوصيل حقنة قفل لور سعة 10 مليلتر بغطاء العمود.

اسحب مكبس المحقنة ثم املأ غطاء العمود بإحكام في الجزء العلوي من العمود. قم بضغط المكبس برفق أثناء تجميع المادة اللاصقة في أسطوانة متدرجة لتقييم معدل التدفق يدويا. تتوافق المعدلات بين ملليلتر وملليلتر في الدقيقة مع الراتنج والإعداد التجريبي.

قم بزيادة ضغط مكبس المحقنة برفق مع تباطؤ معدل التدفق. عندما يصل الغضروف المفصلي للسائل المطبق إلى خمسة إلى 10 ملليلتر فوق طبقة الراتنج ، قم بإزالة غطاء العمود والمضخة اليدوية المرفقة لمنع دخول الهواء إلى الراتنج. دع الحجم المتبقي يستنزف بالجاذبية.

بعد الانتهاء من تصريف المستخلصات الخام وتعرض سطح الراتنج مرة أخرى ، استخدم ماصة باستور لإضافة حوالي 30 مل من محلول الغسيل المبرد بعناية إلى العمود ، مع الحرص على عدم إزعاج سطح الراتنج. افتح المحبس واترك مخزن الغسيل يصرف عبر العمود. أثناء تصريف العمود ، قم بتسمية 16 أنبوبا من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لجمع الكسور.

عندما يتم تصريف المخزن المؤقت تماما وتعرض سطح الراتنج مرة أخرى ، أغلق المحبس. باستخدام ماصة باستور ، أضف بعناية حوالي 30 مل من محلول الشطف المبرد إلى العمود ، مع الحرص على عدم إزعاج سطح الراتنج. بعد ذلك ، افتح محبس ببطء للسماح للمخزن المؤقت للشطف بالتخلص من البروتين الموسوم بالبولي هيستيدين من العمود.

اجمع ملليلتر واحد من المواد المزلئة في كل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المحددة. بعد اختبار البروتين ، امزج الأجزاء المحتوية على البروتين في أنبوب مخروطي نظيف. استمر في إعادة تكوين العامل المساعد للأيون المعدني ، أو قم بتجميد البروتين في ثلاثة مليلتر من الحصص عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لبدء إعادة تكوين المعدن ، ضع كمية من ثلاثة ملليلتر من الإنزيم المنقى ، معلقة في محلول شطف ، على الجليد. باستخدام حجم البروتين في الأنبوب ، احسب كمية أسكوربات الصوديوم وديثيوثريتول اللازمة بحيث يكون التركيز النهائي لكل منهما 12.5 مللي مولار في العينة. أضيفي أسكوربات الصوديوم الصلب وثنائي ثيوثريتول ، واخلطيهم برفق ولكن جيدا ليذوبوا تماما.

اضغط على بضع حبيبات ملليلتر واحد من كبريتات الحديد الصلبة سباعي الهيدرات على قطعة من ورق الوزن. قم بطي الورق فوق الحبيبات وسحقها بالجانب المسطح من ملعقة معدنية. أضف حبة من المسحوق الناتج إلى الأنبوب الذي يحتوي على محلول البروتين.

دوامة للخلط ، مما ينتج عنه لون وردي وردي. قم بتغطية الأنبوب واحتضان المحلول الوردي على الثلج لمدة تتراوح بين 10 و 30 دقيقة. سوف يتلاشى اللون الوردي بمرور الوقت.

لترشيح الهلام ، استخدم عمود ترشيح هلام معبأ ب 10 ملليلتر من هلام بولي أكريلاميد كروي في عمود 1.5 × 12 سم ، وهو مجهز أيضا بخزان 10 ملليلتر. ثم قم بموازنة العمود كما هو موضح في بروتوكول النص. عندما يتم تصريف المخزن المؤقت من العمود وتعرض دعامة السرير العلوي ، أغلق المحبس.

الماصة محلول ثلاثة ملليلتر من الحديد اثنين من الإنزيم المعدني المعاد تشكيله على دعامة السرير العلوي المكشوف. افتح محبس ، واترك عينة الثلاثة ملليلتر بأكملها تدخل العمود عن طريق الجاذبية. تخلص من أول ثلاثة ملليلتر من مادة المزاء.

سيتم احتجاز أي لون وردي يتشكل أثناء التعامل مع المحلول في الجزء العلوي من العمود. عندما يتوقف العمود عن التنقيط ويتعرض دعامة السرير العلوي ، أضف أربعة ملليلتر من مخزن ترشيح الجل ، واجمع أربعة ملليلتر من المحلول على كسور 8.5 ملليلتر. بعد الجمع بين الكسور المحتوية على البروتين ، تابع فحص العينة أو تخزينها كما هو موضح في بروتوكول النص.

في هذه الدراسة ، قام الطلاب بتنقية ثنائي الأكسجين غير المرتبط بالحديد من مادة البولي هيستيدين وإعادة تشكيلها لاحقا. يظهر تحليل SDS-PAGE أن البروتين الموسوم يتم تنقية فعالية. يتم عرض بيانات النشاط التي يجمعها الطلاب حول العمل الأنزيمي ل L-dopa dioxygenase المنقى بعد إعادة التكوين بالحديد الثاني والترشيح الهلامي اللاحق هنا.

يعد التأخر الخمس ثوان قبل بدء جمع البيانات نموذجيا للطلاب الذين ينفذون هذه التقنية لأول مرة. يشير مقايسة الحالة المستقرة إلى أن المعلمات الحركية ، كما يتم تحديدها من خلال ملاءمة منحنيات التقدم ، متوافقة مع النتائج المنشورة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن المزيد من الحديد ليس أفضل ، لأن الكثير من الحديد سيؤدي إلى ترسيب البروتين.

تركيزات الحديد في ثلاثة إلى خمسة مولر فائض من البروتين كافية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن للطلاب إجراء تجارب إضافية لقياس بنية المحلول ، وإلقاء نظرة على الإنزيم أو الكيمياء المعتمدة على الركيزة ، كل ذلك للإجابة على أسئلة إضافية حول آلية التفاعل.