كاينورهابديتيس غربال: صك التكنولوجيا المنخفضة ومنهجية لفرز الكائنات متعددة الخلايا الصغيرة
يوليو 4, 2018
يشمل البروتوكول الحالي منهجية للفرز والتنظيف لمطابقة سن السكان من ايليجانس كاينورهابديتيس. فإنه يستخدم بسيطة وغير مكلفة، وكفاءة أداة مصنوعة خصيصا للحصول على عدد كبير من سكان تجريبية من الديدان الخيطية للبحوث.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك المقايسات التي تتطلب مراحل نمو محددة من C.elegans. مثل فحوصات مستويات التعبير الجيني والبروتيني. تتمثل ميزة هذه التقنية في أنها تسمح بالاختيار الدقيق والفعال لأعداد كبيرة من C.elegans حسب حجم الجسم ، وهذا يسهل استخدام المقايسات التي عادة ما تكون باهظة للوقت والتكلفة.
بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم لا يستطيعون أداء خطوة دوران التقوس أو أنهم لا يحافظون على تدفق المحلول في وسط الشبكة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم خطوات الغسيل والتقليب. قد يواجه البعض صعوبة في تفسير وتصور حركات معينة في النص.
للبدء ، احصل على أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل مع أغطية ، ثم استخدم مثقابا متدرجة لإزالة المركز من الشفة الداخلية للأغطية. إذا لزم الأمر ، استخدم ملفا أو ورق صنفرة أو أداة دوارة لتنظيف وصنفرة حواف وأسطح الأغطية. ثم قم بقص قرص من شبكة منسوجة من النايلون أحادي الشعيرات ، أصغر قليلا من قطر الغطاء.
قم بتركيب الأسطح العلوية للأغطية وتنظيفها بالإيثانول. بعد ترك الأغطية تجف ، ضع غراء سيانواكريليت على الأسطح العلوية لكلا الجفنين. بعد ذلك ، ضع قرص شبكة الشعيرات الأحادية على غطاء واحد لاصق.
اقلب الغطاء الثاني أعلى الشبكة ، واضغط على الأغطية معا بإحكام. بعد أن تجف الطبقة الأولى من الغراء ، ضع حلقة سخية من غراء سيانواكريليت حول الفجوة الخارجية بين الأغطية. بعد ذلك ، قم بتسمية المرشح بحجم المسام الشبكية الخاصة به.
أولا ، ضع المنخل فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ثم قم بعمل محلول ملحي من خلال مركز المنخل حتى تتشكل قطرة وتتجمع وتقطر من مركز المرشح. باستخدام المخزن المؤقت M9 ، اغسل مجموعة من C.elegans من لوحة المثقاب ، ثم استخدم ماصة باستور زجاجية لنقل المخزن المؤقت الذي يحتوي على الديدان على الجانب العلوي من الشبكة أحادية الشعيرات.
تعمل في وسط الشبكة ، اشطف الفلتر باستخدام المخزن المؤقت M9 ، كرر خطوة الشطف هذه حسب الحاجة لتمرير جميع البكتيريا والديدان الصغيرة عبر الشبكة. بعد ذلك ، قم بتوصيل أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل بالجزء العلوي من الغربال ، وستواجه الديدان التي تم جمعها مسبقا أكبر من المسام الموجودة في الشبكة داخل الأنبوب الجديد. قم بإزالة أنبوب النفايات واقلب المنخل بسرعة.
ثم اشطف الشبكة باستخدام المخزن المؤقت M9 في أنبوب التجميع الجديد. اسمح للديدان المجمعة بالاستقرار لمدة دقيقة واحدة تقريبا ، ثم استنشق المحلول العازل بعناية بعيدا عن حبيبات الديدان. باستخدام ماصة باستور زجاجية ، قم بإنشاء قطرات من الديدان على صفيحة NGM واتركها تجف.
أخيرا ، اشطف المنخل بماء التناضح العكسي والإيثانول. بعد أن يجف المنخل ، قم بتخزينه في وعاء نظيف لاستخدامه في المستقبل. تخلص من الغربال عندما يصبح مظهره مترهلا.
في هذا البروتوكول ، تم إنشاء غربال لفرز وتنظيف المجموعات السكانية المطابقة للعمر من C.elegans. أظهرت في مجموعة علاج الغربال نمط حركة طبيعي وتلقائي طوال مرحلة البلوغ. بالإضافة إلى ذلك ، لم تظهر مجموعات الانتقاء والغربال أي اختلافات كبيرة في معدل مضخة البلعوم.
استجابت في مجموعة الغربال أيضا بشكل طبيعي للتحفيز الميكانيكي الأمامي أو الخلفي عند مقارنتها بجميع مجموعات العلاج في أي من أيام الاختبار. أخيرا ، تمت مقارنة خصوبة مجموعات العلاج. لم يؤثر استخدام الغربال بشكل كبير على عدد النسل عند مقارنته بمجموعة علاج الانتقاء. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أقل من عشر دقائق.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل في وسط منطقة الشبكة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع واستخدام منخل Caenorhabditis بشكل صحيح لفرز الديدان حسب حجم الجسم.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول منهجية لفرز وتنظيف مجموعات من ديدان Caenorhabditis elegans متطابقة في العمر باستخدام أداة مُصنعة خصيصاً. وهو يتيح للباحثين الحصول على مجموعة تجريبية كبيرة بكفاءة وبتكلفة اقتصادية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علوم الأعصاب
- البيولوجيا الجزيئية
- البيولوجيا التطورية
خلفية علمية
- تعتبر المراحل النمائية المحددة لـ C.elegans بالغة الأهمية لمختلف المقايسات.
- قد تتضمن المقايسات مستويات تعبير الجينات والبروتينات.
- يمكن أن تكون الطرق التقليدية مستهلكة للوقت ومكلفة.
- تعد العروض المرئية ضرورية لفهم المنهجية.
الغرض من الدراسة
- توفير طريقة فعالة لفرز ديدان *C. elegans* بناءً على حجم الجسم.
- تسهيل إجراء الاختبارات التي تتطلب مراحل نمائية محددة.
- تحسين إمكانية الوصول للباحثين المبتدئين في هذه التقنية.
الطرق المستخدمة
- أداة مصنعة خصيصاً لفرز النيماتودا.
- خطوة تقليب مقوسة لضمان الغسل الفعال.
- الحفاظ على تدفق المحلول في مركز الشبكة.
- توضيحات مرئية للمساعدة في التعلم.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق اختيار دقيق لأعداد كبيرة من *C. elegans*.
- تخفض هذه الطريقة الوقت والتكلفة اللازمين لإجراء فحوصات البيولوجيا الجزيئية.
- تحسين فهم حركات معينة من خلال الوسائل البصرية.
- تعزيز إمكانية الوصول للباحثين غير الملمين بهذه الطريقة.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لفرز C.elegans.
- تعد الوسائل المساعدة البصرية ضرورية للتعلم الفعال لهذه التقنية.
- يمكن لهذه المنهجية أن تفيد أبحاث البيولوجيا الجزيئية بشكل كبير.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
في مجال البحث والتطوير في الصناعات الدوائية الحيوية، يعد الحصول على مجموعات متزامنة من الكائنات النموذجية مثل *C. elegans* أمراً بالغ الأهمية لإجراء فحوصات نمطية قابلة للتكرار ومقايسات التحقق من الأهداف. يتيح منخل Caenorhabditis فرزاً سريعاً ومنخفض التكلفة بناءً على حجم الجسم، مما يقلل من أعباء الوقت والموارد في تدفقات عمل الاكتشاف المبكر. ويدعم ذلك الثقة التنبؤية في جاهزية المقايسة وفرز المحفظة من خلال ضمان مدخلات بيولوجية موحدة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح اختبار الفرضيات العلاجية باستخدام مجموعات من الديدان المتوافقة في العمر للحصول على قراءات مظهرية متسقة.
- القيمة التشغيلية: توفر طريقة منخفضة التكلفة وقابلة للتوسع لإنشاء مجموعات متزامنة دون الحاجة إلى معدات متخصصة.
- القيمة التنبؤية: تقلل التباين البيولوجي في المقاييس، مما يحسن موثوقية البيانات لتقليل المخاطر المرتبطة بالأهداف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تهيئة أنظمة بيولوجية تم التحقق من صحتها لعمليات فحص المركبات اللاحقة عن طريق عزل مراحل نمائية محددة.
- القيمة التشغيلية: توحيد معايير تحضير الديدان، مما يعزز إمكانية تكرار النتائج عبر أطباق المقايسة وحملات الفحص.
- القابلية للتوسع: دعم احتياجات الإنتاجية العالية من خلال المعالجة السريعة لمجموعات كبيرة من الديدان في أقل من عشر دقائق.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يحافظ على الدقة المظهرية بدءاً من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال الحفاظ على مؤشرات الحركة والاستجابة للإجهاد والخصوبة.
- تقليل المخاطر الآلية: يتيح تقييماً موثوقاً لمستويات تعبير الجينات والبروتينات في المجموعات المتزامنة، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية.
- التقدم المعدل وفقاً للمخاطر: يسهل اتخاذ قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) من خلال توفير مدخلات متسقة لنظام النموذج المستخدم في توصيف الفعالية والسمية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتناسب منخل Caenorhabditis ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف بدءاً من مرحلة الاكتشاف المبكر وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، حيث تدعم بشكل خاص جاهزية المقايسات وقابلية تكرار الفحص في عمليات الفحص المظهري القائمة على C. elegans.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال توفير مجموعات موحدة من الديدان لتوضيح المسارات والفحص الوظيفي.
- الفحص: تتيح الجاهزية للاختبار من خلال الفرز القائم على الحجم، مما يضمن اتساق حجم الديدان ومراحلها لتقييم المكونات بشكل موثوق.
- التحليلات: تُنتج مخرجات كمية مفصولة حسب الحجم تسمح للفرق بمقارنة الظروف عبر مراحل النمو مع تقليل الضجيج.
- البحث الانتقالي: تربط الاستمرارية قبل السريرية من خلال الحفاظ على علامات الصحة الرئيسية (الحركية، والاستجابة للإجهاد، والخصوبة) بعد الفرز، مما يدعم صلاحية المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كأداة قابلة لإعادة الاستخدام ومنخفضة الصيانة عبر الفرق والمشاريع، مما يعزز التوحيد القياسي في التعامل مع الكائنات النموذجية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في المقاييس المظهرية.
- القيمة التشغيلية: توحيد معايير سير عمل تحضير الديدان، وقابلية تكرارها، وقابليتها للتوسع.
- القيمة الاستراتيجية: اتخاذ قرارات أفضل بشأن المتابعة أو التوقف، وكفاءة رأس المال، وتقليل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة عبر التخفيف المبكر للمخاطر.
- تأثير المحفظة: اتخاذ قرارات الترتيب حسب الأولوية والتقدم بناءً على بيانات موثوقة لأنظمة نماذج محددة لمرحلة معينة مع تعديل المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب مهارات مختبرية أساسية لتجميع المنخل والتعامل مع المحاليل.
- يتطلب توفر أنابيب مخروطية، وشبكة نايلون، وغراء سيانوأكريلات، ومحاليل منظمة قياسية (M9، ومحلول ملحي).
- يستلزم تدريب الفرق المشتركة على التشغيل السليم المرتكز على الشبكة وتقنية القلب لضمان الاتساق.
- تشمل اعتبارات التكيف اختيار حجم مسام الشبكة لمراحل الديدان المستهدفة والتوافق مع مختلف أنظمة NGM أو أنظمة المزارع السائلة.
- تشمل القيود العملية احتمالية ترهل الشبكة بمرور الوقت، مما يتطلب استبدالها بشكل دوري للحفاظ على دقة الفرز.
