دراسة Ribonucleotide التأسيس: كشف حبلا على حدة Ribonucleotides في جينوم الخميرة وقياس الطفرات المستحثة Ribonucleotide

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة مثل عدد الريبونوكليوتيدات التي تم دمجها في الحمض النووي الخيطي الناشئ والرائد والمتأخر في الجينوم. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر معلومات كمية ونوعية فيما يتعلق بكثافة الريبونوكلياتيدات في جينوم الخميرة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل جينومات الثدييات. يوفر الرحلان الكهربائي للهلام القلوي رؤية شبه كمية لدمج الريبونوكليوتيدات في الجينوم بأكمله ويسمح النشاف الجنوبي المحدد للخيط بمزيد من الحساسية والكمية في موضع جيني معين.

لبدء هذا الإجراء ، أضف ستة ميكرولترات من هيدروكسيد البوتاسيوم المولي إلى كل عينة من الحمض النووي الجيني للخميرة المحضرة حديثا واحتضانها عند 55 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، احتضان العينات على الجليد لمدة خمس دقائق. ثم أضف إلى كل عينة أربعة ميكرولترات من 6-6 مخزن مؤقت لتحميل الحمض النووي القلوي.

صب هلام قلوي يتكون من واحد بالمائة من الاغاروز و 50 ملليمولار هيدروكسيد الصوديوم وواحد مليمولار EDTA درجة الحموضة ثمانية بمشط يسمح بتحميل 24 ميكرولترا من عينة الحمض النووي لكل حارة. قم بتدوير أنابيب العينات لفترة وجيزة. قم بتحميل 24 ميكرولترا بالكامل من كل عينة في هلام الاغاروز القلوي.

قم بتضمين علامة حجم الحمض النووي المناسبة. الكهربائي عند 30 فولت لمدة 30 دقيقة. ثم اخفض الجهد إلى 10 فولت والكهربية لمدة 18 إلى 20 ساعة.

في اليوم التالي ، قم بتحييد الجل. اغمر الجل في مخزن مؤقت للتحييد واحتضانه في درجة حرارة الغرفة مع تقليب لطيف لمدة 45 دقيقة. استبدل مزيج المخزن المؤقت للتحييد بمخزن مؤقت جديد.

واحتضن لمدة 45 دقيقة أخرى. لتلطيخ الحمض النووي ، انقع الجل المحايد في 200 مل من الماء الذي يحتوي على مخفف من واحد إلى 10000 من بقعة سيبر الذهبية في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف لمدة ساعتين. تصور الحمض النووي باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية.

سيتم نقل الحمض النووي من الجل القلوي إلى غشاء نايلون موجب الشحنة عن طريق العمل الشعري. نقع الجل القلوي أولا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في مخزن مؤقت للنقل القلوي. بعد ذلك ، بلل غشاء النايلون لفترة وجيزة بالماء وانقعه في مخزن مؤقت للنقل القلوي لمدة خمس دقائق.

قم بإعداد منصة النقل عن طريق قلب ثلاث أكواب زجاجية سعة 100 مل في طبق خبز زجاجي أكبر قليلا من حجم جل الاغاروز. ضع لوحا زجاجيا فوق الأكواب الزجاجية. ثنى قطعتين كبيرتين من ثلاثة ورق كروماتوغرافيا MMCHR فوق اللوحة الزجاجية.

صب المخزن المؤقت للنقل القلوي فوق ورق الكروماتوغرافيا واملأ نصف الطبق الزجاجي. قم بتنعيم الفقاعات باستخدام ماصة زجاجية سعة خمسة ملليلتر. ضع جل الاغاروز في الأعلى.

مرة أخرى ، تنعيم الفقاعات. أحيط جميع حواف الجل بالبارافيلم. صب كمية صغيرة من المخزن المؤقت للنقل القلوي على الجل.

ضع غشاء النايلون المنقوع مسبقا فوق الجل وقم بتنعيم الفقاعات. ضع قطعتين من ورق الكروماتوغرافيا مقطوعة بحجم جل الاغاروز. ضعها فوق الغشاء وقم بتنعيم أي فقاعات.

ضع كومة كبيرة من المناشف الورقية فوق شطيرة النقل وضع طبقا زجاجيا بحذر فوق المناشف الورقية. أضف جسما مرجحا إلى الأعلى واترك النقل يستمر في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بتفكيك كومة النقل بعناية.

انقع الغشاء في درجة حرارة الغرفة في مخزن مؤقت للتعادل لمدة 15 دقيقة. اربط الحمض النووي بغشاء النايلون المشحون باستخدام رابط متقاطع للأشعة فوق البنفسجية. استخدم إعداد الارتباط المتقاطع التلقائي.

قبل البدء في إجراء التهجين ، قم بإعداد المسبار الموسوم بالإشعاع كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بلف الغشاء المبلل في أنبوب تهجين وأضف 25 مل من مخزن التهجين المحضر حديثا. احتضان درجة حرارة 65 درجة مئوية مع الدوران في فرن تهجين لمدة ساعة إلى ساعتين.

اسكب المحلول بحذر وأضف 25 مل من مخزن التهجين بالإضافة إلى المسبار. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة مع الدوران. بعد ذلك ، اسكب المحلول في حاوية نفايات مشعة.

أضف محلول غسيل الفوسفات STS إلى أنبوب التهجين وقم بتدويره في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بهذه الطريقة ، قم بإجراء خمس غسلات مدة كل منها خمس دقائق بمحلول غسيل الفوسفات STS واحد. بعد الغسيل الخامس بمحلول غسيل الفوسفات STS ، اغسل الغشاء مرتين بمحلول غسيل الفوسفات STS ، اثنان لمدة 15 دقيقة ، كل مرة عند 65 درجة مئوية مع الدوران.

استخدم الملقط لإزالة الغشاء من أنبوب التهجين ووضع الغشاء في واقي غلاف بلاستيكي مفتوح. قم بتغطيته وعرضه على لوحة تصوير. إذا لزم الأمر ، قم بتجريد اللطخة وإعادة ضبطها بمسبار مختلف.

للتجريد ، قم بتغطية الغشاء ب 25 مل من محلول فورماميد 2XSSPE بنسبة 50 في المائة واحتضانه عند 65 درجة مئوية لمدة ساعتين. صب المحلول في حاوية نفايات مشعة. أضف محلول غسيل الفوسفات STS اثنين إلى أنبوب التهجين ، وقم بتدويره عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

افحص الغشاء باستخدام عداد جيجر لتأكيد عدم وجود إشارة قبل إجراء التهجين المسبق والتهجين كما هو موضح سابقا. تحتوي صور الهلام هذه على الحمض النووي الجيني للخميرة المعالج بهيدروكسيد البوتاسيوم أو بدونه ، مما يظهر أن الخلايا التي تفتقر إلى RNH2 تحتفظ بمزيد من الريبونوكليوتيدات في الجينوم. يقلل متغير M644L من البوليميراز الثاني من القدرة على دمج الريبونوكليوتيدات بينما يشتمل المتحور M644G على المزيد من الريبونوكليوتيدات من البوليميراز من النوع البري.

يمكن فحص هلام الاغاروز القلوي بشكل أكبر عن طريق تحليل اللطخة الجنوبية الخاصة بالخيوط. في هذا المثال ، تقوم المجسات بتلدين خيط الحمض النووي الرائد الناشئ داخل جين مراسل URA3 الذي تم إدخاله بالقرب من ARS306 في اتجاهين متعاكسين. تظهر النتائج التمثيلية للنشاف الجنوبي باستخدام المجسات الخاصة للخيط الرئيسي الناشئ نمطا تجزئة الحمض النووي الناجم عن الانقسام القلوي في الريبونوكليوتيدات والحمض النووي للخيوط الرائدة الناشئة في سلالة من النوع البري وفي السلالات التي تعبر عن متغيرات البوليميراز ألفا ودلتا وإبسيلون المختلطة لدمج الريبونوكليوتيدات.

يوضح هذا الرسم البياني التقدير الكمي للإشارة المشعة بجزء من الإجمالي في كل حارة من اللطخة الجنوبية. أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما استخدام الحمض النووي المعزول حديثا من خلايا الوجه القفلية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال إصلاح الحمض النووي لتحديد الكثافة والخيط الذي تم دمج الريبونوكليوتيدات فيه بواسطة بوليميرات الحمض النووي التكاثرية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التسلسل النهائي المائي أو HydEn-seq ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل موقع الريبونوكليوتيدات في الجينوم. لا تنس أن العمل مع المواد المشعة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات لتجنب تلوث طاولة العمل والمعدات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.