تصوير ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع من المنظمة الخلوية في اللحاء الجديد الماوس
September 5th, 2018
هنا يصف لنا إجراء لإزالة الأنسجة ووسم الفلورسنت والتصوير على نطاق واسع لانسجة المخ الماوس الذي، وبالتالي يمكن تصور منظمة ثلاثية الأبعاد لأنواع الخلايا في اللحاء الجديد.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب مثل تحليل بنية ووظيفة القشرة المخية الحديثة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تكشف عن الهيكل ثلاثي الأبعاد واسع النطاق في الدماغ. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للقشرة المخية الحديثة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأجهزة العصبية الأخرى مثل النخاع الشوكي.
لحقن المتتبع في جسر الفئران البالغة ، ارسم أولا ميكرولتر واحدا من الوحدة الفرعية لسم الكوليرا B في حقنة هاميلتون عيار 26. ضع مضخة حاقن على المحقنة ، ثم ضع المحقنة والمضخة على حامل أداة مناور على أداة تجسيمية. قم بإمالة المناور 12 درجة للخلف من المحور الرأسي.
بعد ذلك ، ضع الماوس على الأداة التجسيمية. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بإزالة شعرها لمنع العدوى. ثم قطع 10 ملليمترات من فروة الرأس بحيث تكون بريجما ولاجدا مرئية.
قم بإدارة 0.1 ملليلتر من 1٪ ليدوكائين باستخدام ماصة. اضبط زاوية الرأس عن طريق ضبط الوضع الرأسي لقطعة الفم على الأداة التجسيمية بحيث يكون للبريجما واللامدا نفس مستوى Z. بعد ذلك ، اضبط موضع المناور عن طريق تحريكه على الأداة التجسيمية بحيث يكون طرف المحقنة قريبا من البريجما.
سجل موضع المعالج. اسحب المحقنة عن طريق تحريك حامل الأداة على المعالج. بعد ذلك حرك المناور 5.4 ملم للخلف و 0.4 ملم جانبيا.
ادفع المحقنة بحيث يكون الطرف قريبا من نقطة الدخول على الجمجمة ، ثم اسحب المحقنة وحدد نقطة الدخول. في الموضع المحدد ، قم بحفر حفرة يبلغ قطرها حوالي ملليمتر واحد. أدخل طرف المحقنة من خلال الفتحة بحيث يكون عمق الطرف أكثر بمقدار 6.9 ملم من العمق المقاس عند البريجما.
بعد ذلك ، قم بحقن ميكرولتر واحد من أدوات التتبع باستخدام المضخة بسرعة 0.2 ميكرولتر في الدقيقة. بعد الحقن ، قم بإزالة المحقنة من الدماغ. إذا لزم الأمر ، قم بتغطية الدماغ المكشوف بشظايا صغيرة من الإرقاء الليفي الدقيق والمادة اللاصقة الفورية.
امسح الدماغ المكشوف بالمحلول الملحي لمنع العدوى وخياطة فروة الرأس. بعد ذلك ، قم بإزالة الماوس من الأداة التجسيمية. اسمح للفأر بالتعافي من التخدير في حاضنة عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة تقريبا.
لا تترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. أعد الفأر إلى صحبة الأخرى بعد تعافيه بالكامل. لجمع أنسجة المخ ، قم بقص فروة الرأس باستخدام مقص لكشف الجمجمة.
بعد ذلك ، قم بقص خط الوسط للجمجمة المكشوفة باستخدام مقص. ثم قم بإزالة الجمجمة باستخدام الملقط. إذا كان من الضروري تحديد موضع البريجما واللامدا ، فقم أولا بإزالة جانب واحد من الجمجمة.
ثم أدخل إبر التنغستن الرقيقة في الدماغ في مواضع بريجما ولامدا ، ثم قم بإزالة الجمجمة المتبقية. بعد ذلك ، ضع عينة الدماغ على منصة الاهتزاز. قطع الأقسام التي يصل سمكها إلى 500 ميكرومتر في PBS في درجة حرارة الغرفة.
في هذا الإجراء ، انقل الشرائح إلى أنبوب بلاستيكي سعة خمسة ملليلتر يحتوي على أربعة ملليلتر من محلول Scale S0. ثم احتضنها لمدة 12 ساعة مع رج لطيف عند 37 درجة مئوية. بعد 12 ساعة ، قم بإزالة المحلول من الأنبوب باستخدام ماصة وأضف أربعة ملليلتر من محلول مقياس A2.
احتضن الشرائح لمدة 36 ساعة مع رج لطيف عند 37 درجة مئوية. بعد 36 ساعة ، قم بإزالة المحلول من الأنبوب وأضف أربعة ملليلتر من محلول Scale B4. احتضن الشرائح لمدة 24 ساعة مع رج لطيف عند 37 درجة مئوية.
بعد 24 ساعة ، قم بإزالة المحلول من الأنبوب وأضف أربعة ملليلتر من محلول Scale A2. احتضن الشرائح لمدة 12 ساعة مع رج لطيف عند 37 درجة مئوية. بعد 12 ساعة ، قم بإزالة المحلول من الأنبوب وأضف أربعة ملليلتر من PBS.
احتضن الشرائح لمدة ست ساعات مع رج لطيف في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة الشرائح بعناية إلى أنبوب بلاستيكي سعة ملليلتر. احتضنها بجسم مضاد أساسي في مليلتر واحد من محلول AB Scale لمدة 48 إلى 72 ساعة عند 37 درجة مئوية مع رج لطيف.
بعد ذلك ، قم بإزالة الشرائح بعناية إلى أنبوب بلاستيكي سعة خمسة ملليلتر. احتضنها في أربعة ملليلتر من محلول AB Scale لمدة ساعتين مرتين في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. بعد ذلك ، قم بإزالة الشرائح بعناية إلى أنبوب بلاستيكي سعة ملليلتر.
احتضان بجسم مضاد ثانوي يحمل علامة الفلورسنت في مليلتر واحد من محلول AB Scale لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية مع رج لطيف. قم بإزالة الشرائح بعناية إلى أنبوب بلاستيكي سعة خمسة ملليلتر يحتوي على أربعة ملليلتر من محلول مقياس الجسم المضاد واحتضان الشرائح لمدة ست ساعات مع رج لطيف في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المحلول وأضف أربعة ملليلتر من محلول AB Scale واحتضن الشرائح لمدة ساعتين مرتين مع رج لطيف في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول وأضف أربعة ملليلتر من 4٪ PFA واحتضان الشرائح لمدة ساعة واحدة مع رج لطيف في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة المحلول وأضف أربعة ملليلتر من PBS واحتضان الشرائح لمدة ساعة واحدة مع رج لطيف في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المحلول وأضف أربعة ملليلتر من محلول Scale S4 واحتضان الشرائح لمدة 12 ساعة مع رج لطيف عند 37 درجة مئوية.
بعد ذلك ، ضع الفاصل على شريحة زجاجية وضع الشرائح في الفاصل واغمر الشرائح في محلول Scale S4. أغلق الفاصل بغطاء زجاجي. ضع بعض الماء على زجاج الغطاء وقم بتصوير الشرائح باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر أو ثنائي الفوتون مع هدف الغمر في الماء ومسافة العمل الطويلة.
في هذه الدراسة ، تم تصنيف الخلايا العصبية القشرية الإسقاط باللون الأخضر بواسطة تعبير tdTomato في الفئران المعدلة وراثيا Tlx3-cre AI9 وتم تصور الخلايا العصبية الإسقاط تحت الدماغي في الأرجواني عن طريق حقن التتبع الرجعي CTB488 في الجسر في عمر سبعة أسابيع. هذا هو العرض العلوي لإظهار المواضع التقريبية للمناطق القشرية. فيما يلي المناظر المائلة لمضان CTB488 التي تظهر الخلايا العصبية الإسقاط الدماغي الفرعي و tdTomato المضان الذي يظهر الخلايا العصبية الإسقاط القشري وهذه هي الصورة المدمجة.
كانت أجسام الخلايا من نوعي الخلايا مرئية على نطاق واسع من مناطق الدماغ وأظهرت الأقسام البصرية أعمدة دقيقة دورية. تظهر هذه الصورة أجسام الخلايا والتشعبات القمية للخلايا العصبية الإسقاط الدماغي التي تعبر عن eGFP في القسم البصري لفأر Crym-eGFP وتظهر هذه الصورة الخلايا التي تعبر عن البارفألبومين المسماة بالخلايا العصبية الإسقاط الخضراء وتحت الدماغية المسماة باللون الأرجواني عن طريق حقن CTB488 في جسر فأر C57 Black 6 بطريقة مقياس الأجسام المضادة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل معالجة الصور ثلاثية الأبعاد من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التوصيف الكمي للتنظيم الدماغي.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء القشري لاستكشاف تنظيم معياري جديد في دماغ الفأر.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تحدد هذه الدراسة بروتوكولًا مفصلًا لشفافية الأنسجة، والتسمية الفلوروفورية، والتصوير واسع النطاق لأنسجة دماغ الفأر. تتيح المنهجية للباحثين تصور التنظيم ثلاثي الأبعاد لأنواع الخلايا في القشرة الجديدة، مما يوفر رؤى قيّمة حول هيكلها ووظيفتها.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تصوير الأنسجة
- التسمية الفلوروفورية
الخلفية
- الهيكل والوظيفة للقشرة الجديدة أساسية في علم الأعصاب.
- فهم تنظيم الخلايا يمكن أن يساعد في الإجابة على أسئلة البحث الرئيسية.
- يمكن تمديد هذه التقنية إلى مناطق أخرى في الجهاز العصبي، مثل الحبل الشوكي.
هدف الدراسة
- تطوير منهجية لتعزيز تصور هياكل الدماغ.
- التحقيق في تنظيم أنواع الخلايا داخل القشرة الجديدة.
- توفير إطار عمل قابل للتطبيق على دراسات الجهاز العصبي الأوسع.
الطرق المستخدمة
- التصوير واسع النطاق باستخدام الفحص المجهري الليزري ال confocal أو ثنائي الفوتون.
- النموذج المستخدم يشمل فئران بالغة ومناطق محددة في الدماغ مثل الجسر.
- يحدد البروتوكول الخطوات الإجرائية لحقن المتتبع وتحضير الأنسجة.
- كانت الحضانة في محاليل مثل Scale S0، A2، B4، واستخدام الأجسام المضادة الفلوروفورية خطوات حاسمة.
النتائج الرئيسية
- تكشف الطريقة عن هياكل ثلاثية الأبعاد واسعة النطاق في أنسجة دماغ الفأر.
- تحققت تسمية محددة لخلايا الإسقاط القشرية وأنواع أخرى من الخلايا.
الاستنتاجات
- تظهر هذه الدراسة طريقة قوية لتصور التنظيم العصبي.
- تسهم النتائج بشكل كبير في فهم هيكل القشرة الجديدة ووظيفتها.
- يمكن تكييف المنهجية لتطبيقات متنوعة في أبحاث علم الأعصاب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding the three-dimensional cellular architecture of complex tissues like the neocortex supports target validation by revealing spatially resolved organization of neuronal subtypes. This mechanistic insight enables de-risking of therapeutic hypotheses through direct visualization of target engagement and network-level organization in disease-relevant systems. The method provides predictive confidence in preclinical models by linking anatomical organization to functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping cell-type-specific microcolumn organization in the neocortex.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of neuronal subtypes and their spatial relationships.
- Predictive Value: Enhances target confidence by resolving periodic functional modules relevant to network-level drug effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving three-dimensional tissue architecture.
- Operational Value: Enables reproducible imaging workflows through standardized tissue clearing and labeling protocols.
- Scalability: Facilitates platform reuse across brain regions and complex tissues via motorized stage scanning and long-working-distance objectives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage organization insights to preclinical validation through disease-relevant system modeling.
- Mechanistic De-risking: Supports risk-adjusted advancement decisions by visualizing target engagement across distributed neural networks.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural phenotypes with functional outputs for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing spatially resolved, quantitative anatomical data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-type-specific organization in intact tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible tissue preparation and quantitative fluorescence readouts.
- Analytics: Enables comparative analysis via three-dimensional imaging and cell counting across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving disease-relevant tissue architecture for longitudinal study.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable to multiple brain regions and complex tissues beyond the neocortex.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through direct visualization of neuronal organization and microcolumn periodicity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined tissue clearing, labeling, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in complex tissue systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking anatomical phenotypes to functional outcomes in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, tissue preparation, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to confocal or two-photon microscopes with large working distance objectives and motorized stages.
- Necessitates cross-team standardization for tissue clearing, antibody labeling, and imaging protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse model systems such as spinal cord or human tissue surrogates.
- Limited by tissue size and optical penetration depth, which may restrict imaging of whole-brain samples without sectioning.
