بيولوجيا الخلية كمية من نيوروديجينيريشن في المورفولوجية من خلال تحليل غير منحازة للبروتينات فلوريسسينتلي المعلمة باستخدام إيماجيج

لقد قمنا بتطوير سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف لاستخراج البيانات الكمية من دراسات بيولوجية الخلية المستندة إلى تصوير fluorescence تجميع البروتين والتمويه أوتوفاجيك في الجهاز العصبي المركزي لنماذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن.

قمنا بتطوير هذه الطريقة لاستخراج البيانات الكمية من دراسات التصوير القائمة على التألق لاستخراج العمليات البيولوجية الخلوية المعقدة والديناميكية في ذبابة الفاكهة نماذج التنكس العصبي. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في سير عمل تحليل الصور القابل للتكيف وشبه الآلي لتقليل تحيز التحديد ، وتعظيم قوة أخذ العينات ، وتحقيق قابلية التكرار عبر المجال. يمكن توسيع هذا النهج لتحليل النقاط البروتينية الأخرى والمقصورات المرتبطة بالغشاء المتورطة في التنكس العصبي والتي ستعزز في النهاية فهمنا الميكانيكي للأمراض التنكسية العصبية.

للحفاظ على الصفيحة سليمة أثناء التشريح تحت مجهر مجسم ، حرك ملقطين تحت شبكية العين ومزق منتصف العين برفق لإزالة شبكية العين. مع الحفاظ على الملقط موازيا لسطح الصفيحة ، اسحب أي أنسجة شبكية متبقية متصلة بالصفيحة. قم بتشريح ثلاثة إلى خمسة أدمغة لكل مجموعة وانقل الأدمغة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على مثبت مناسب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.

بعد ثلاث غسلات لمدة 15 دقيقة باستخدام PBS plus Triton X-100 ، أو PBTx ، استبدل الغسيل الأخير بالجسم المضاد الأساسي ذي الاهتمام المخفف في PBTx بمصل الماعز العادي بنسبة 5٪ للحضانة طوال الليل في خلاط aliquot عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الجسم المضاد الزائد بثلاث غسلات لمدة 15 دقيقة في PBTx واحتضان الأدمغة في جسم مضاد ثانوي مناسب مخفف في PBTx مع مصل الماعز العادي بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اغسل الأدمغة ثلاث مرات كما هو موضح ، وضع قطرة من وسط التثبيت بين قطعتين من الشريط الشفاف في وسط شريحة مجهرية واحدة لكل عينة من الأنسجة.

ضع الدماغ في وسائط التركيب لمدة دقيقة إلى دقيقتين. عندما تصبح الأنسجة شفافة ، استخدم ماصة لإزالة وسيط التثبيت بعناية من كل جانب. لتصوير الأنسجة الملطخة ، ضع قطرة من وسط التثبيت الجديد على الأدمغة وقم بتراكب العينات بعناية بزجاج الغطاء.

أغلق الحواف الزجاجية للغطاء بالأسمنت المطاطي وجفف الشرائح بالهواء لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اعرض العينة على المجهر واضبط عناصر التحكم في كاشف الصور على المجهر الفلوري لالتقاط أعلى نسبة إشارة إلى ضوضاء في أعلى نطاق ديناميكي للعينة. بمجرد تحسين الإعدادات ، اعرض عينة من مجموعة أخرى للتأكد من أن الإعدادات ستكون مناسبة عبر التجربة.

يمكن بعد ذلك تصوير العينة الأولى مع الحرص على حفظ الصورة كنوع ملف يمكنه الحفاظ على البيانات الوصفية مثل معلمات الاستحواذ والمعايرة المكانية. لتحليل الصور، افتح صورة في فيجي، حدد View Stack باستخدام Hyperstack من مربع الحوار Bio-formats Import Options وقم بتعيين وضع اللون إلى Grayscale. حدد منطقة بناء على قنوات العلامة التي يمكن استخدامها كمنطقة موحدة ذات أهمية عبر العينات باستخدام شريط التمرير C لعرض القنوات وشريط التمرير Z للتحرك عبر المستويات البؤرية.

لتبسيط تحليل الصورة ، قم بإنشاء صورة جديدة تحتوي على القنوات ومستويات البؤرة وحدد صورة ومكررة. قم بتعيين القنوات والشرائح المطلوبة وقم بتغيير اسم الملف ليعكس التحديد. حدد منطقة اهتمام موحدة يدويا باستخدام أداة التحديد استنادا إلى معايير التحديد المحددة مسبقا.

انقر فوق تحليل وأدوات ومدير منطقة الاهتمام وإضافة لإضافة منطقة الاهتمام إلى إدارة منطقة الاهتمام. ثم انقر فوق المزيد وحفظ وقم بتسمية الملف ليعكس منطقة الاهتمام. للمعالجة المسبقة للصور، انقر فوق Process in Filters وحدد عامل تصفية مناسب.

هنا حدد إعدادات المرشح التي تقلل الضوضاء مع الحفاظ على الحواف للمساعدة في اكتشاف الهياكل ذات الأهمية أثناء التجزئة. مع تنشيط الصورة التي تمت معالجتها مسبقا في فيجي، انقر فوق SCF ووضع العلامات و H_Watershed التفاعلية. من لوحة التحكم، اضبط ديناميكيات البذور وعتبة الكثافة وذروة الفيضانات لتحسين التجزئة.

عندما يتم تحسين نتائج التجزئة، حدد قناع مناطق التصدير والتصدير لإنشاء صورة ثنائية لنتائج مستجمعات المياه. افتح منطقة الاهتمام القياسية المحفوظة. من إدارة منطقة الاهتمام، حدد معرف منطقة الاهتمام لتقييد استخراج الميزة بالمنطقة القياسية ذات الاهتمام في الصورة.

مع تنشيط منطقة الاهتمام على قناع مستجمعات المياه الثنائية، حدد تحليل الجسيمات وإضافة إلى المدير لاستخراج الميزات لإضافة معرف جسيمات لكل بنية محددة أثناء التجزئة إلى إدارة منطقة الاهتمام. ثم احفظ الجسيمات المضافة مع الحرص على إلغاء تحديد المعرفات وحفظ جميع الجسيمات في ملف مضغوط. افتح الآن الصورة الأولية التي تمت معالجتها مسبقا وقم بالتمرير إلى القناة المستخدمة لالتقاط الهياكل ذات الأهمية.

افتح الجسيمات التي تم الحصول عليها من استخراج الميزة وحدد إظهار الكل في إدارة منطقة الاهتمام لتراكب مخطط تفصيلي لكل جسيم على الصورة. انقر فوق تحليل وتعيين القياسات وتعيين القياسات وتعيين القياسات التجريبية المناسبة. ثم من إدارة منطقة الاهتمام، حدد قياس ونسخ النتائج والصقها في برنامج جدول بيانات مناسب للتجميع والمزيد من العمليات الحسابية.

يكشف القياس الكمي لعدد مجاميع هنتنغتون RFP المجزأة شبه تلقائيا من المستويات البؤرية القياسية من خلال الفص البصري ذبابة الفاكهة عن تعبير منتشر عن توسع هنتنغتون Q15 غير الممرض في تراكم مجاميع البروتين من خلال توسع هنتنغتون Q138 المسبب للأمراض. توضح ملفات تعريف الحجم والشدة لجميع الركام من مستوى بؤري موحد لخمسة فصوص بصرية مختلفة تعبر عن هنتنغتون Q138 متانة وقابلية تكرار سير العمل هذا. عندما تكون التجميعات مفرطة في التعريض أثناء الحصول على الصور، فإن القياس الكمي لحجم وعدد المجاميع يمكن مقارنته بالتجميعات التي تم التقاطها مع التعريض الضوئي المثالي.

ومع ذلك ، تصبح شدة المجاميع المكشوفة بشكل مفرط دالة للحجم حيث تظهر وحدات البكسل المشبعة قيمة الكثافة القصوى. يكشف تصور شدة mCherry و GFP عبر العديد من الهياكل الإيجابية المتعلقة بالالتهام الذاتي أو Atg8 عن اختلافات في المراسل حيث تشير الكثافة العالية لكل من الفلوروفورات إلى البلعمة الذاتية. يشير ارتفاع mCherry و GFP المنخفض إلى الاندماج مع الليزوزوم حيث يتم إخماد GFP في هذه الحجرة الحمضية.

وأخيرا ، يعكس mCherry المنخفض التدهور داخل الليزوزوم. يوضح المخطط المبعثر الناتج عن متوسط شدة الفلوروفور لكل جسيم موجبة mCherry Atg8 مجزأ شبه تلقائي التدفق عبر مسار الالتهام الذاتي للجسيم الليزومي الذي يمكن فصله إلى خطوات منفصلة عن طريق التحليل الرباعي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن المعلمات المعرفة من قبل المستخدم في خطوات تحليل الصور تعتمد بشكل كبير على التطبيق.

لذا احرص على توثيق سير العمل لضمان الاتساق وقابلية المقارنة عبر العينات.