تحديد الفيرومونات لامبرى البحر باستخدام تجزئة تسترشد الحشري

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيئة الكيميائية ، مثل تحديد الفيرومونات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تربط المركبات الجديدة بوظيفة الفرمون. لبدء هذا الإجراء ، ضع 15-30 من لامبري البحر الناضج جنسيا في خزان مزود ب 250 لترا من مياه بحيرة هورون الغازية ، ويتم الحفاظ عليها عند 16-18 درجة مئوية.

لاستخراج المياه المكيفة عن طريق استخراج الطور الصلب ، قم بتمريرها من الخزان عبر نظام الضخ إلى أعلى العمود. يمر الماء عبر طبقة من كيلوغرامين من راتنج التبادل الأيوني البوليمري القطبي المعتدل الموجود في سلسلة من أربعة أعمدة زجاجية بسعة لتر واحد. بعد ذلك ، قم بإزالة المذيب العضوي وحصاد المستخلص عن طريق التبخر الدوار لمدة خمس ساعات تحت ضغط منخفض عند 40 درجة مئوية.

لعزل أحواض الكسور ، انقع هلام السيليكا في المرحلة المتنقلة الأولية لمدة 30 دقيقة. انقل الجل مع المذيب إلى عمود زجاجي وافتح صممه للسماح للمرحلة المتنقلة بالمرور. بعد ذلك ، امزج المستخلصات مع هلام السيليكا جيدا وقم بتحميلها في عمود الكروماتوغرافيا السائلة فوق طبقة هلام السيليكا.

بإزالتها بتدرج من 95٪ من الكلوروفورم إلى الميثانول إلى 100٪ من الميثانول ، مما ينتج عنه إجمالي 2.5 لتر ، ثم اجمع المادة المزيلة في قوارير فردية سعة 10 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بإجراء تجربة TLC على ألواح هلام السيليكا المطلية مسبقا عن طريق تطبيق العينة على خط البداية وغمر خط البداية للوحة في المذيب النامي في خزان زجاجي مغلق. بعد أن يصل المذيب النامي إلى خط النهاية ، أخرج اللوحة من الخزان وانتظر 10 دقائق حتى يتبخر المذيب.

تخيل البقع ، أولا تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 254 نانومتر ، ثم تلطيخ اللوحة عن طريق رشها بمحلول ميثانول حمضي بنسبة 5٪ أنيسالديهايد باستخدام بخاخ كروماتوغرافيا وتسخينه عند 85 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، قم بتركيز الكسر على بقايا عن طريق التبخر الدوار تحت ضغط منخفض عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا. لإجراء تسجيل EOG ، املأ الأقطاب الكهربائية الشعرية ذات القطب القطبي وحاملات أقطاب الحالة الصلبة ، مسبقة الصنع بحبيبات كلوريد الفضة والفضة ، بكلوريد البوتاسيوم ثلاثي المولار باستخدام ماصة دقيقة.

ثم أدخل الأقطاب الكهربائية القطبية في حوامل الأقطاب الكهربائية. بعد ذلك ، قم بإعداد 100 مل من 10 إلى ناقص خمسة مولار L-arginine في الماء المصفى بالفحم من 10 إلى محلول مخزون L-arginine ناقص اثنين من المولار في الماء منزوع الأيونات في قارورة حجمية. بالنسبة لمنحنى استجابة التركيز ، قم بإعداد 10 ملليلتر من التخفيفات بمقدار 10 أضعاف لتجمعات الكسور.

الآن ، قم بتوجيه لامبري مخدر في حامل على شكل حرف V ولفه بمنشفة ورقية مبللة لمنع الجفاف. أدخل أنبوبا من الماء الغازي المعاد تدويره يحتوي على 50 ملليغرام لكل لتر من MS222 في تجويف الخد. اضبط معدل التدفق وتأكد من خروج الماء عبر فتحات الخياشيم لري الخياشيم باستمرار.

اغسل أنبوب توصيل الرائحة بالماء المصفى وقم بتوصيله بالصمام المركب على مناور دقيق. بعد ذلك ، ضع الأنبوب الشعري لتوصيل الرائحة في تجويف الظهارة الشمية لتوصيل الماء المفلتر إلى الظهارة الشمية لمنع الجفاف عند عدم إعطاء الروائح. بعد ذلك ، قم بتركيب أقطاب التسجيل والمرجعية على المعالجات الدقيقة.

اخفض القطب المرجعي على الجلد الخارجي بالقرب من الأنف. باستخدام المجهر المجسم ، اخفض قطب التسجيل ليلمس بالكاد سطح الظهارة الشمية. بعد ذلك ، قم بنقل امتصاص أنبوب توصيل الرائحة من الماء المصفى في الخلفية إلى محلول L-arginine 10 إلى ناقص خمسة موليات.

قم بتشغيل الكمبيوتر ومكبر الصوت والفلتر والمحول الرقمي. باستخدام برنامج تشغيل الصمام ، قم ببرمجة الإجراء لإدارة نبضة واحدة مدتها أربع ثوان من الرائحة عن طريق تحديد مربع T1 ، وضبط T على أربع ثوان ، وتحديد مربع T2.In برنامج الحصول على البيانات ، وتعيين وضع الاستحواذ على راسم الذبذبات عالي السرعة. انقر فوق أيقونة التشغيل ثم انقر فوق ابدأ في مشغل الصمام لتشغيل نبض الرائحة.

ابدأ في تسجيل عنصر التحكم الفارغ ، L-arginine ، ثم الروائح الكريهة من تركيزات منخفضة إلى عالية مع تدفق لمدة دقيقتين من الماء المصفى بين التطبيقات. لتحديد الكسور النشطة سلوكيا ، تأقلم أنثى لامبري البحر الناضجة جنسيا في قفص الإطلاق في المتاهة لمدة خمس دقائق. حرر لامبري البحر وسجل مقدار الوقت التراكمي الذي يقضيه لامبري في قناة التجربة والتحكم ، كل منها يحتوي على مياه النهر ، لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بتطبيق محفز الاختبار على القناة التجريبية المخصصة عشوائيا في السيارة إلى قناة التحكم باستخدام المضخات التمعجية بمعدلات ثابتة تبلغ 200 مليلتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق ، ثم قم بتطبيق محفز الاختبار في السيارة لمدة 10 دقائق إضافية وسجل مقدار الوقت التراكمي الذي يقضيه لامبري في القنوات التجريبية والقناتي التحكم. في هذا الإجراء ، قم بتنقية الكسور النشطة إلى مركبات ذات كروماتوغرافيا استبعاد الحجم باستخدام عمود sephadex LH-20. قم بإعداد العينة في 0.5 مل من المرحلة المتنقلة الأولية ، وتحميلها في عمود الكلوروفورم إلى الميثانول ثم عمود الميثانول ، وقم بإزالة الكسور النشطة لإنتاج المركب.

قم بإذابة وتخفيف المركب المنقى في المرحلة المتنقلة الأولية من HPLC لتشكيل محلول 10 ميكرولتر يبلغ حوالي ميكروغرام واحد لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بنقل محلول العينة إلى قوارير HPLC وقم بتعيينها في جهاز أخذ العينات التلقائي ل HPLC. حقن العينة في مطياف كتلة التأين بالرش الكهربائي وتسجيل أطياف قياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي عالي الدقة باستخدام مطياف كتلة الكروماتوغرافيا.

قم بإذابة العينة تماما في المذيبات المختارة لتشكيل محلول بتركيز يتراوح من 0.1 إلى 10 ملليغرام لكل ملليلتر. انقل محلول العينة إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي لتسجيل أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1D و 2D على مطياف الرنين المغناطيسي النووي 900 ميغاهيرتز. يظهر هنا مطياف الرنين المغناطيسي النووي 600 ميجاهرتز.

تم تحديد خمسة فيرومونات لامبري البحر المفترضة الجديدة وتم توضيح هياكلها بطرق القياس الطيفي والطيفي. كانت هذه الفيرومونات المفترضة محفزة للظهارة الشمية لامبري البحر البالغ وكان لها عتبات اكتشاف منخفضة في تسجيلات المسح الصوتي الكهربائي. في المقايسات السلوكية المتاهة ذات الاختيار الثنائي ، انجذبت لامبري البحر الإناثي المبويضة إلى Petromyzone A و Petromyzene A و Petromyzene B ، وتم صدها من Petromyzone C. أثناء محاولة هذا الإجراء متعدد التخصصات ، من المهم أن تتذكر تنسيق التجارب الكيميائية والبيولوجية لتنفيذ هذا البروتوكول التكراري.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل علم البلورات بالأشعة السينية وتفاعلات الاشتقاق من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الكيمياء الفراغية للمركبات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المنتجات الطبيعية وعلم الأعصاب لاستكشاف التخليق الحيوي المعقول والوظيفة البيولوجية للفيرومونات في الكائنات المائية مثل لامبري البحر. لا تنس أن العمل باستخدام الكلوروفورم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل العمل في الغطاء الكيميائي ، وارتداء القفازات ، ونظارات السلامة ، أثناء التعامل مع هذا الكاشف.