تحديد وعزل أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت النقوي موروث من نخاع العظام الماوس

يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة لأخصائيي أمراض الدم وعلماء المناعة الذين يدرسون إنتاج ووظيفة الخلايا النخاعية ، بما في ذلك العدلات والخلايا الوحيدة والخلايا المتغصنة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح تحديدا أكثر دقة للمجموعات الفرعية السلف النخاعي من الاستراتيجيات السابقة. لإثراء خلايا نخاع العظم للأسلاف عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا ، أو MACS ، قم بتقطيع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 40 ميكرولترا من مخزن تلطيخ MACS لكل مرة واحدة في 10 إلى خلايا نخاع العظم السبع.

لاستنفاد الخلايا الإيجابية للنسب المتمايزة ، أضف 10 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة للبيوتين كل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع وتخلط عن طريق سحب العينة لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، أضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتلوين لكل مرة في 10 إلى الخلايا السبع مع الخلط ، متبوعا ب 20 ميكرولترا من الميكروبيدات المضادة للبيوتين لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع. بعد 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، اغسل الخلايا بملليلتر واحد من مخزن التلوين لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من مخزن التلوين الطازج لما يصل إلى مرة واحدة في 10 إلى ثماني خلايا.

بعد ذلك ، قم بإعداد الفاصل المغناطيسي الآلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وضع أنبوب الخلايا المسمى في الفاصل. ابدأ برنامج الاختيار السلبي لجمع الكسر السالب الذي يحتوي على الخلايا السالبة للسلالة المخصبة للسلف. بيليه الخلايا السلبية للسلالة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات ، التي أصبحت الآن بيضاء ، في ملليلترين من المخزن المؤقت لكل فأر للعد.

لعزل الخلايا السلفية النخاعية بواسطة FACS ، أضف مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السالبة للسلالة الخامسة إلى كل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الثمانية للتحكم لاختيار الجهد وتعويض اللون وأضف باقي عينة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق التاسع للتلوين بجميع الأجسام المضادة السبعة لعلامة السطح ذات الأهمية لتحديد السلف وفرزه. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق كريات التحكم في 100 ميكرولتر من مخزن تلطيخ FACS وحبيبات العينة التجريبية في 100 ميكرولتر من محلول التلوين لكل خمس مرات 10 إلى الخلايا الست. بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد المضاد ل CD16 / CD32 إلى أنبوب وصمة عار مفردة لمستقبلات جاما Fc وأنبوب العينة.

دوامة برفق واحتضان العينات لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، أضف الأجسام المضادة الأخرى إلى أنابيب البقع المفردة المناسبة وإلى أنبوب العينة وبعد الدوامة اللطيفة ، احتضن العينات لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، أضف 900 ميكرولتر من مخزن التلوين إلى أنابيب التحكم ومليلتر واحد من مخزن التلوين لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع إلى أنبوب العينة للطرد المركزي.

أعد تعليق كريات التحكم في 200 ميكرولتر من مخزن التلوين الطازج لكل أنبوب والحبيبات التجريبية في 500 ميكرولتر لكل 2.5 في 10 إلى الخلايا السبع ونقل الخلايا المسمى إلى أنابيب FACS الفردية المقابلة بسعة خمسة ملليلتر. ثم قم بإعداد مقياس التدفق الخلوي وفقا للبروتوكولات القياسية واستخدم عناصر التحكم غير الملوثة والمفردة الملطخة لضبط الفولتية وتعويضات الألوان. لتحديد وعزل الخلايا السلفية النخاعية ، قم بتحميل عينة الخلية التجريبية على مقياس الخلوي وقم بإنشاء منطقة تشتت أمامية مقابل مخطط منطقة التشتت الجانبي ، والبوابات لاستبعاد الحطام والخلايا الميتة.

قم بإنشاء ارتفاع مبعثر أمامي مقابل مخطط عرض مبعثر أمامي للخلايا الحية والبوابة لاستبعاد المضاعفات. كرر هذه العملية مع ارتفاع مبعثر جانبي مقابل مخطط عرض التشتت الجانبي للمفردات المفردة المبعثرة الأمامية والبوابة لاستبعاد الزوجي. قم بإنشاء مخطط وبوابة Sca-1 مقابل c-Kit لتحديد الأسلاف السالبة ل c-Kit Sca-1 الإيجابية.

ثم قم بإنشاء مخطط وبوابة مستقبلات جاما CD-34 مقابل FC لتحديد السلف النخاعي المشترك المختلط ومجموعات سلف الخلايا الحبيبية الوحيدة المختلطة. من المهم بوابة السلف النخاعي المشترك المختلط ومجموعات السلف أحادية الخلايا الحبيبية المختلطة بأكبر قدر ممكن من الدقة. قد يكون من المفيد استخدام مخطط كثافة الألوان الزائفة أو مخطط كفاف للحصول على بوابات أكثر دقة.

استخدم الخلايا الموجودة في بوابة السلف النخاعي المشترك المختلطة لإنشاء مخطط وبوابة CD115 مقابل Flt3 لتحديد الخلايا المنخفضة CD115 الإيجابية للسلف النخاعي الشائع Flt3 ، والخلايا المنخفضة CD115 السلبية السلبية للسلف النخاعي الشائع Flt3 ، وأسلاف الخلايا المتغصنة عالية الخلايا أحادية الخلايا الإيجابية ل CD115. استخدم الخلايا الموجودة في بوابة سلف الخلايا الحديدية المختلطة لإنشاء مخطط وبوابة مستقبلات Ly6C مقابل FC Gamma لتحديد الخلايا السالبة Ly6C والخلايا الإيجابية Ly6C. ثم قم بإنشاء مخطط CD115 مقابل Flt3 لكل مجموعة سكانية فرعية للخلايا السلفية أحادية الخلايا المحببة المختلطة المسورة وبوابة أسلاف الخلايا الوحيدة السلبية السلبية Ly6C Flt3 CD115 السلبية منخفضة الخلايا الحبيبية ، و Ly6C إيجابي Flt3 سلبي CD115 أسلاف الخلايا الحبيبية المنخفضة ، و Ly6C إيجابي Flt3 سلبي CD115 أسلاف الخلايا الأحادية العالية.

الأقصى لنضوب النسب فعال في استنفاد الخلايا المتمايزة وإثراء الخلايا السلفية الإيجابية c-Kit. لا يزال الجزء السالب للنسب يحتوي على بعض الخلايا السالبة c-Kit ، ولكن سيتم التخلص من هذه الخلايا في خطوات بوابات قياس التدفق الخلوي اللاحقة. يمكن أن تختلف عوائد السلف بعد فرز FACS اعتمادا على إعدادات الفرز المستخدمة ، ولكن يجب أن يكون من الممكن الحصول على ما بين واحد إلى أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة لكل كسر من كل فأر بنقاوة ما بعد الفرز أكبر من 95٪ لكل جزء.

التلوين الجيد أمر بالغ الأهمية للفصل النظيف بين السكان. قد تحتاج إلى معايرة الأجسام المضادة أو اختيار فلوروفورات مختلفة لضمان الفصل الأمثل. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الخلايا السلفية لتقييم الاختلافات في تكوين نخاع العظم بين العينات ، لعزل الأسلاف للتحليل الجزيئي أو لتقييم قدرتها على إنتاج الخلايا النخاعية.