تحديد المحتوى فيكوبيليبروتين في سيانوباكتيريوم سينيتشوسيستيس سبيكتروفوتوميتريك

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد محتوى البروتينات النباتية كميا في نموذج البكتيريا الزرقاء Synechocystis باستخدام طريقة القياس الطيفي. البروتينات النباتية هي مجمعات بروتين صبغي قابلة للذوبان في الماء تمثل المكونات الرئيسية لهوائيات حصاد الضوء في البكتيريا الزرقاء بدائية النواة وعدة مجموعات من الطحالب حقيقية النواة. نظرا لأنها المجمعات الرئيسية لحصاد الضوء ، فإن البروتينات النباتية تمثل أحد العوامل الحاسمة التي تحدد إنتاجية الطحالب والبكتيريا الزرقاء.

Synechocystis هو نموذج زرق يستخدم في مئات المختبرات في جميع أنحاء العالم. يحتوي Synechocystis على اثنين من البروتينات النباتية ، فيكوكيانين وألوفيكوسيانين. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة وموثوقة للتحديد الكمي لكل من البروتينات الفيكوبيلية في سلالة العفن هذه.

قارنا عدة طرق ، استخراج البروتينات النباتية والقياس الكمي الطيفي. يجب اختبار طريقة القياس الكمي لكل سلالة لأن أطياف امتصاص البروتينات النباتية يمكن أن تختلف بين السلالات المختلفة. في بداية استخراج البروتينات النباتية ، انقل ملليلتر واحد من ثقافة البكتيريا الزرقاء إلى أنبوب قفل آمن.

إذا قررت تحديد الوزن الجاف للعينات ، فقم بوزن الأنابيب الفارغة قبل أخذ عينات الثقافة. تأكد من أن الثقافة ليست مترسبة. الطرد المركزي للخلايا عند 15،000 غرام في درجة حرارة المختبر لمدة خمس دقائق.

تخلص بعناية من المادة الطافية تأكد من عدم إزعاج الحبيبات. ضع العينات في الفريزر.

للتخزين طويل الأجل ، احتفظ بالعينات عند 80 درجة مئوية. هذا ضروري لمنع تدهور البروتينات النباتية. بمجرد تجميد العينات ، أدخلها في مجفف التجميد.

بمجرد بدء التجفيف بالتجميد ، تحقق من درجة الحرارة والضغط على مجفف التجميد. يجب أن تكون درجة الحرارة أقل من 60 درجة مئوية ويجب أن يكون الضغط حوالي هكتار واحد من باسكال. تجميد العينات تجميد وجفف طوال الليل.

بعد الانتهاء من دورة التجفيف بالتجميد ، أغلق الأنابيب في أسرع وقت ممكن لمنع إعادة امتصاص الماء من الهواء. أضف أربعة أجهزة كمبيوتر من حبات زجاجية ملليلتر إلى كل أنبوب عينة. قم بتجانس العينات بالخرز الزجاجي لمدة 15 ثانية.

تنتشر العينة المتجانسة بشكل صحيح على السطح الداخلي بالكامل لأنابيب القفل الآمن. بعد تجانس الخلايا ، أضف ملليلترا واحدا من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات إلى العينات من أجل استخراج البروتينات النباتية. يبلغ الرقم الهيدروجيني الأمثل ل PBS حوالي 7.4.

امزج الخلايا مع PBS لمدة خمس ثوان على الخالط. سيؤمن ذلك خلط العينات الأمثل لاستخراج البروتينات الليفية بكفاءة. بعد الخلط ، تكون العينات خضراء.

احتفظ بالعينات على الجليد لمدة 60 دقيقة لاستخراج البروتينات النباتية الأكثر كفاءة. بعد الاستخراج ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 15 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، يكون للطافي اللون الأزرق السماوي.

قبل القياس الطيفي الضوئي ، قم بمعايرة مقياس الطيف الضوئي باستخدام PBS كفارغ. بمجرد معايرة مقياس الطيف الضوئي ، يتم التخلص من PBS من كوفيت واحد لمقياس الطيف الضوئي وماصة المادة الطافية ببروتينات نباتية مستخرجة بدلا من المخزن المؤقت المهمل. لقياس الفيكوسيانين والألوفيكوسياانين ، يتم قياس المادة الطافية مع البروتينات النباتية المستخرجة عند 615 و 652 و 720 نانومتر.

كما هو موضح في النص ، هناك العديد من المعادلات لقياس الفيكوبيليزومات المعروفة في الأدبيات. تم العثور على المعادلة المستخدمة في هذا البروتوكول على أنها أفضل تركيزات الفيكوسيانين والألوفيكوسيانين كأصباغ ونقاط. تتمثل الخطوات الحاسمة للبروتوكول في تجانس الخلايا واستخراجها ، والتي يجب أن توفر إنتاجية عالية وخصوصية عالية.

اختبرنا العديد من إجراءات الاستخراج مثل تعطيل الخلايا عن طريق الصوتنة ، أو التجانس مع حبات الزركونيا ، أو تجميد ارتباط الخلية. قدمت الطريقة من هذا البروتوكول أعلى عائد من الفيكوبيليسوم. نظرا لأنه حتى التلوث الصغير لمستخلص البروتين بالكلوروفيل يمكن أن يؤدي إلى المبالغة في تقدير محتوى البروتينات النباتية ، فمن الضروري تجنب أي استخراج للكلوروفيل من الخلايا.

اكتشفنا الكلوروفيل في المستخلص الخام ، ثم استخدمنا صوتنة لاضطراب الخلايا. مع تكرار دورات صوتنة ، زاد تركيز الكلوروفيل. تم تحسين وقت التجانس على أنه 15 ثانية.

قدم التجانس لكل من خمس ثوان و 20 ثانية عوائد أقل قليلا. إضافة كلوريد الصوديوم أو كلوريد البوتاسيوم إلى المخزن المؤقت PBS أو إلى الماء ، لم تزيد من كفاءة استخراج البروتينات الليفية ، مثل الاستخراج في المخزن المؤقت لأسيتات الصوديوم. تم تحسين وقت استخراج البروتينات النباتية لمدة 60 دقيقة ، لأنه بعد 120 وحتى 240 دقيقة ، لم يتغير تركيز البروتينات الفيكوبيلية بشكل كبير.

تأكد من أن الامتصاص عند 615 و 652 و 720 نانومتر يتناسب مع نطاق الامتصاص القريب لمقياس الطيف الضوئي. يظهر مقياس الطيف الضوئي المستخدم في هذا البروتوكول نطاق الامتصاص القريب بين 0.1 وثلاثة. قارنا عدة معادلات للقياس الكمي للبروتينات النباتية الطيفية المعروفة من الأدبيات.

قدمت معادلة بينيت وبوجوراد أفضل إعادة بناء لكل من محتوى الفيكوسيانين والألوفيكوسياانين في معايير الصباغ بتركيزات البروتين المعروفة. ترتبط الاختلافات بين المعادلات الفردية بالاختلافات في معاملات انقراض البروتينات النباتية للكائن الحي المحدد. لم يؤد استخدام كبريتات الستربتومايسين إلى تقليل الكلوروفيل أ في العينات التي تم فيها تطبيق الصوتنة أو تجنبها.

كبيانات تمثيلية ، حددنا محتوى البروتينات النباتية في خلايا Synechocystis. انخفض محتوى البروتينات النباتية تحت زيادة الضوء. تم إنشاء البروتوكول لتقليل متطلبات الوقت والمعدات لتحليل الصبغة المكتوب الذي يمكن إجراؤه في أي مختبر قياسي للعلوم الحية.

أيضا ، يحتوي البروتوكول على خطوتين أخريين ، مثل التجفيف بالتجميد لحبيبات الخلية واستخراج البروتينات. إجمالي وقت العمل لقياس الفيكوبيليسومات لا يزيد عن ساعتين.