دينامية البروتين وميرنا "تحليل بوليسوميس" من "قلب الفأرة متفرقة بعد نضح لانجيندورف"

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تخليق البروتين الديناميكي والبروتين المشارك في العملية. تسمح هذه التقنية بتحديد الحمض النووي الريبي المرسال التي يتم اختيارها للترجمة ، والحمض النووي الريبي الصغير الذي يمكن أن يشارك في العملية ويتداخل مع الترجمة ، والبروتينات التي تساهم في ترجمة البروتين أو التي تتم ترجمتها بنفسها. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للاستجابات القلبية للإجهاد ، ولكن يمكن تطبيقها أيضا على دراسة الاستجابات الحادة للإجهاد في الأعضاء الأخرى.

ستظهر الإجراء ميروسلافا ستاستنا ، عالمة المشروع من مختبر جينيفر فان إيك. في يوم التجربة ، املأ المقصورة اليسرى لخلاط التدرج بخمسة ملليلتر من محلول تدرج السكروز بنسبة 15٪ ، واملأ المقصورة اليمنى بخمسة ملليلتر من محلول تدرج السكروز بنسبة 50٪. افتح الصنبور وقم بتشغيل المضخة لتقليب المقصورتين الصغيرتين باستخدام محرك مغناطيسي ، واستخدم أنبوبا مرتبطا بالصنبور الثاني للسماح لمحاليل السكروز المختلطة بالتدفق إلى أنبوب طرد مركزي واحد بجدران رقيقة على الجليد.

بعد ذلك ، قم بتجانس أنسجة القلب الطازجة أو المجمدة باستخدام POLYTRON في مخزن مؤقت للتحلل المصفى لمدة 15 ثانية على الجليد. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للمحللات لإزالة المادة غير القابلة للذوبان ، وحصاد المادة الطافية. ضع جانبا 50 ميكرولترا من المادة الطافية لتحديد البروتين وعزل الحمض النووي الريبي وتحليل سلامة الحمض النووي الريبي ، وطبقة من 100 إلى 500 ميكرولتر من المادة الطافية المتبقية فوق محلول التدرج.

استخدم عازلة التحلل الجديدة لموازنة الأحجام بين أنبوبي التدرج ، وقم بالطرد المركزي الفائق للعينات في جهاز طرد مركزي فائق باستخدام دوار دلو متأرجح. احرص على عدم إزعاج تدرج السكروز قبل أو بعد الطرد المركزي. لجمع التدرجات ، قم ببرمجة مجمع الكسور للتخلص من الدقائق الثلاث الأولى من التجميع وجمع الكسور الثقيلة والخفيفة وغير المترجمة بسرعة مليلتر واحد في الدقيقة في 17 كسرا من أربع إلى 19 دقيقة مع المراقبة المستمرة للامتصاص عند 254 نانومتر.

ضع كل جزء على الجليد بمجرد جمعه. ثم قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، إذا لم تتم معالجتها على الفور. لاستخراج البروتينات من الكسور المتعددة ، اجمع كسور السكروز المجمعة في ثلاثة أجزاء نهائية ، وقم بتمييز الكسور على أنها ثقيلة وخفيفة وغير مترجمة.

امزج 0.5 مل من كل عينة مع 60 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك 100٪ ، أو TCA. احتضن الكسور بين عشية وضحاها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر في الظلام. في صباح اليوم التالي ، قم بإذابة العينات على الجليد قبل تكوير البروتينات عن طريق الطرد المركزي.

تخلص من المواد الطافية ، واغسل الكريات مرتين ب 0.5 مل من الأسيتون المبرد المبرد 20 درجة مئوية تحت الصفر لكل طرد مركزي. تأكد من إذابة الحبيبات ، بعد ترسيب TCA ، تماما ، باستخدام صوتنة النبض لضمان الذوبان الكامل ، حسب الضرورة. جفف الكريات بالهواء بعد الغسيل الأخير قبل إعادة التعليق في 360 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-HCl.

ثم أضف 40 ميكرولترا من الديثيوثريتول لمدة 45 دقيقة عند 55 درجة مئوية مع الرج. في نهاية الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من اليودوأسيتاميد إلى العينات لحضانة لمدة 30 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء ، متبوعة بهضم العينات بنسبة من واحد إلى 50 من الوزن إلى الوزن من التربسين إلى البروتين لحضانة الاهتزاز طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، بعد التبريد ، قم بالطرد المركزي للعينات لفترة وجيزة ، واضبط الرقم الهيدروجيني إلى اثنين إلى ثلاثة باستخدام حمض الفورميك بنسبة 10٪ لإرواء نشاط التربسين.

لتحلية العينات ، قم أولا بتكييف المادة الماصة في آبار صفيحة مكونة من 96 بئرا ب 200 ميكرولتر من الميثانول ثلاث مرات ، متبوعا بالتكييف ب 200 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ لكل بئر ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بتحميل العينات على كل بئر ، واغسل العينات ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ لكل غسلة. باستخدام الجاذبية ، متبوعا بفراغ منخفض ، قم بتصفية العينات ب 100 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ في 50٪ أسيتونيتريل مرتين في أنبوب واحد منخفض الاحتفاظ بالبروتين 0.5 مليلتر لكل عينة.

ثم استخدم مكثفا لتبخير العينة التي تشطف إلى الجفاف ، وإعادة تكوين كل حبيبات ببتيد تربتيك في 50 إلى 100 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ لتحليل قياس الطيف الكتلي. يمكن إجراء تحليل mRNA لتقييم توزيع mRNA معين ذي أهمية في كل جزء أو للقياس الكمي والمقارنة بين كسور الترجمة المتعددة الريبوسومات المدمجة إلى الكسر غير المترجم كنسبة من وفرة mRNA لكل جزء. على سبيل المثال ، هنا ، تظهر التغييرات في توزيع الرنا المرسال عبر الكسور المترجمة وغير المترجمة بعد إخضاع قلب الفأر لنقص التروية أو نقص التروية ، مقارنة بعلاج القلب الوهمي.

في هذه التجربة التمثيلية ، كشف تحليل مجموعة فرعية من microRNAs في الكسور الثقيلة المجمعة أن 22 microRNAs مرتبطة بpolysomes أثناء نقص التروية ، وتسعة منها مرتبطة أثناء نقص التروية وإعادة التروية ، وسبعة كانت شائعة في كلتا الحالتين ، مما يدل على أن ارتباط microRNAs ديناميكي استجابة لضغوط نقص التروية وإعادة التروية. علاوة على ذلك ، تم تحديد غالبية بروتينات الريبوسومات في الميتوكوندريا في الجزء الخفيف ، وتم تحديد غالبية البروتينات الريبوزومية العصارية الخلوية بشكل شائع في كل من الكسور الثقيلة والخفيفة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توخي الحذر الشديد مع تدرج السكروز.

تم اختيار ترسيب TCA لاستخراج البروتينات من الكسور المتعددة في سير عملنا بناء على كل من القدرة على معالجة الجزء بتركيز عال من السكروز وعدد البروتينات التي تم تحديدها بواسطة قياس الطيف الكتلي. بشكل عام ، قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب التحديات المرتبطة بقابلية تكرار تدرج السكروز. يعتبر هطول الأمطار TCA مفيدا نظرا لأن هناك حاجة إلى كميات صغيرة فقط لترسيب البروتينات ، وتكون الحبيبات مرئية في قاع الأنبوب ، ولا يوجد تراكم للسكروز أثناء هطول الأمطار.