تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم الأحياء الضامة والخلايا المتجذّر حول التعريب شبه الخلوي وديناميات البروتينات المختلفة في أنواع الخلايا هذه. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة نسبيا، وغير مكلفة، ويظهر كفاءة أفضل واستقرار التعبير من غالبية الأساليب الأخرى المتاحة. إثبات الإجراء سيكون جارميلا كرالوفا، طالبة غراد من مختبري.

لإنتاج الفيروس الرجعي، لوحة تعليق خلية واحدة من خلايا التعبئة والتغليف البيئية البلاتين في طبق بتري 10 سم وزراعة الخلايا في 15 ملليلتر من DMEM، تستكمل مع مصل الأبقار الجنين 10٪، أو FBS، حتى الثقافة هي 50 إلى 60٪ التقاء. في اليوم التالي، إضافة 20 ميكروغرام من بناء retroviral من الفائدة و 10 ميكروغرام من ناقل التعبئة البيئية PCL إلى 1 ملليلتر من DMEM دون المصل، مع خلط لطيف. إضافة 75 microliters من PEI في 1 ملليلتر من DMEM دون المصل والمضادات الحيوية إلى أنبوب ثان لمدة خمس دقائق حضانة في درجة حرارة الغرفة، وخلط محتويات كلا الأنابيب معا لاحتضان إضافية لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، بعناية استبدال المتوسطة على الخلايا البيئية البلاتينية مع 8 ملليلتر من 37 درجة مئوية جديدة DMEM تكملها 2٪ FBS وإضافة بعناية خليط transfection في قطرات إلى لوحة. بعد حضانة 4 ساعة في 37 درجة مئوية، استبدال supernatent مع 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية DMEM، تكمل مع 10٪ FBS لاحتضان 24 ساعة في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استخدم ماصة 5 ملليلتر لنقل جسيمات التغذية الرجعية المحتوية على الجسيمات الفائقة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر وإزالة الحطام واحتواء الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

وفي الوقت نفسه، إضافة 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS إلى طبق الثقافة لاحتضان آخر 24 ساعة في 37 درجة مئوية وجمع جولة ثانية من الجسيمات الفيروسية كما أظهرت للتو. لحصاد نخاع العظم، في غطاء لثقافة الأنسجة، استخدم ملاقط ومقص لإزالة الجلد وجزء من العضلات من الأطراف الخلفية وإبعاد الاسيبولوم بعناية من مفصل الورك دون كسر عظم الفخذ. قطع الكفوف في مفاصل الكاحل ورش العظام مع 70٪ الإيثانول.

ثم إزالة بقية العضلات بمنشفة ورقية ووضع العظام في طبق بتري 5 سم من برنامج تلفزيوني تكملها 2٪ FBS. بعد ذلك، ثني مفصل الركبة لكل مجموعة العظام وفصل بعناية العظام مع مقص. استخدام مقص لإزالة حوالي 1-2 ملليمتر من كل epiphysis من عظم واحد واستخدام حقنة ملليلتر اثنين أو خمسة مجهزة إبرة قياس 30 محملة برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى FBS لطرد نخاع العظام من طرفي العظم في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.

عندما تم جمع النخاع من كل من العظام، بيليه خلايا العظام عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 2.5 ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة لتحلل لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخبط، تصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 100 في أنبوب جديد 15 ملليلتر الطرد المركزي واستعادة المثابرة مع 12 ملليلتر من برنامج تلفزيوني زائد FBS. إعادة تعليق بيليه في DMEM، تستكمل مع 10٪ FBS والمضادات الحيوية للعد وطبقة خمس إلى 10 مرات 10 إلى خلايا نخاع العظام السادسة في 10 سنتيمترا، غير الأنسجة ثقافة علاج طبق بيتري في 10 ملليلتر من DMEM تكملها مصل ومستعمرة الضامة عامل تحفيز، أو MCSF.

في اليوم الخامس من الثقافة، إمالة بعناية طبق ثقافة الخلية وإزالة جميع ولكن ما يقرب من 5 ملليلتر من المتوسطة من السطح بالقرب من حافة الطبق. ثم إضافة 20 ملليلتر من 37 درجة مئوية جديدة المتوسطة تكملها FBS وMCSF إلى الطبق وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية. لحصاد الخلايا، في اليوم السادس إلى السابع، إزالة جميع الخلايا المتوسطة والعائمة وغسل الثقافة مع PBS 37 درجة مئوية.

فصل الخلايا المرتبطة مع خمسة ملليلتر من 0.02٪EDTA وBBS لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الأنسجة واستخدام ماصة خمسة ملليلتر لطرد بلطف الخلايا المفككة من أسفل لوحة. ثم نقل الخلايا إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر يحتوي على 25 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد. للحث EGFP تمييز تعبير البروتين في نخاع العظم مستضد مشتقة تقدم الخلايا, في بداية بروتوكول تمايز الخلية, تمييع خلايا نخاع العظام إلى 2-5 مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من DMEM بالإضافة إلى FBS والمضادات الحيوية conentration وطبق الخلايا من ملليلتر واحد من المتوسط في بئر, تستكمل مع السيتوكين التمايز المناسب.

بعد أربع إلى ست ساعات في حاضنة ثقافة الخلية، إضافة ملليلتر من الجولة الأولى من الفيروس الذي تم جمعه تكملتها مع البوليبرين وtransduce ثقافات الخلية عن طريق الطرد المركزي واحتضان أربع ساعات في الحاضنة ثقافة الخلية. وفي نهاية فترة النقل، تنقل الخلايا غير المُضَع من كل بئر إلى أنابيب فردية للطرد المركزي يبلغ 15 ملليلتر، وتجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إذا كانت هناك حاجة إلى كمية أكبر من الخلايا، يمكن أن تكون الخلايا مصابة بنفس النتوءات في آبار متعددة وتجمع قبل التمايز.

ثم إعادة تعليق الكريات في 10 ملليلتر من المتوسطة الثقافة تكمل مع السيتوكين التمايز المناسب وطبق الخلايا على واحد 10 سنتيمتر غير ثقافة الأنسجة تعامل بتري طبق في أنبوب، لثقافة ستة إلى ثمانية أيام، كما أظهرت للتو. تقييم فعالية البلاتين Eco transfection بواسطة تدفق cytometry بعد جمع الفيروس الثاني الذي يحتوي على supernatent يكشف عن متوسط كفاءة transfection من 62 ٪ لSPIP2 - EGFP و 53 ٪ لOPAL1 - EGFP. لا يؤثر نقل الفيروس الرجعي على حالة التمايز للخلايا المشتقة من نخاع العظم مع أكثر من 90٪ من الخلايا في كلتا الثقافتين مما يدل على الإيجابية لعلامات كل منها بعد الحمل مع أي من الفيروسين.

ومع المناسبة، التغيرات المورفولوجية المميزة التي لوحظت لكلا النوعين من الخلايا المتمايزة. ملاحظة, التعبير الكلي من EGFP كان أقل في نخاع العظام المشتقة الثقافات الخلية المتجنّدة مقارنة مع نخاع العظم مشتقة التعبير EGFP، بغض النظر عن نوع الفيروس الرجعي. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر لاستخدام غير الأنسجة، والثقافة يعامل الأطباق البلاستيكية التي تستخدم عادة لزراعة البكتيريا إذا كنت تخطط لإزالة الخلايا من الطبق للتجربة.

بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام أساليب أخرى التصوير الحي للخلايا، والمجهر الفائق الدقة أو أنواع أخرى من المجهر للإجابة على أسئلة إضافية حول التعريب شبه الخلوي وديناميات بروتينات الخلايا المتجخرة والكبرية ذات الأهمية. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة في استكشاف توزيع والعلاقات الزباقية للبروتينات التي تعبر عنها الضامة والخلايا التشعبية وفي تعزيز فهمنا لوظيفة هذه البروتينات أثناء الاستجابات المناعية. لا تنس أن العمل مع الجسيمات الفيروسية يمكن أن تكون خطرة للغاية، وأنه ينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات، مثل الحد الأدنى من توليد الهباء الجوي، وارتداء معدات واقية، واستخدام غطاء محرك تدفق لامينر، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.