تصور المتغيرات الجينية وأهداف قصيرة والطفرات في سياق الأنسجة المورفولوجية الجيش النيبالي الملكي في الموقع تهجين المقايسة
August 14th, 2018
هنا، يمكننا وصف في الموقع تهجين الإنزيم الذي تمكن من كشف حساسة ومحددة لمتواليات قصيرة قدر النيوكليوتيدات 50 مع قرار واحد-النوكليوتيدات على مستوى خلية واحدة. المقايسة، التي يمكن أن يؤديها يدوياً أو تلقائياً، يمكنك تمكين التصور المتغيرات لصق ومتواليات قصيرة، والطفرات في سياق النسيج.
يمكن أن تعالج هذه الطريقة أسئلة البحث الرئيسية في علم الأعصاب والأورام وما بعدها ، مثل التعبير المحدد لنوع الخلية ورسم الخرائط المكانية لمتغيرات لصق داخل الدماغ والبيئات الدقيقة للورم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تكتشف تقاطعات exon والتسلسلات القصيرة والطفرات النقطية في سياق الأنسجة بحساسية وخصوصية عالية جدا في الخلايا المفردة. سيوضح الإجراء Hell Pimentel ، وهو عالم مشارك من مختبرنا.
لتحضير الأنسجة ، قم بإصلاحها مباشرة بعد التشريح في الفورمالين المحايد المخزن بنسبة 10٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 إلى 32 ساعة. بعد ذلك ، تتم معالجة العينة وتضمينها في البارافين باستخدام الإجراءات القياسية. قم بتقطيع الأنسجة المضمنة إلى خمسة أقسام زائد أو ناقص ميكرون واحد باستخدام ميكروتوم.
قم بتركيب الأقسام على شرائح زجاجية لاصقة إلكتروستاتيكية وجففها في الهواء في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. قبل ساعة واحدة من إجراء فحص تهجين RNA NC2 ، ضع شرائح الأنسجة المثبتة في رف منزلق واخبزها في فرن هواء دائري على حرارة 60 درجة مئوية. قبل بدء مقايسة تهجين RNA NC2 ، تأكد من ضبط فرن التهجين على 40 درجة مئوية.
بلل ورق الترطيب جيدا ، وقم بإزالة أي ماء متبقي ، وضع الغطاء على درج التحكم في الرطوبة. قم بإعداد 200 مل من كاشف استرجاع الهدف 1X المتاح تجاريا عن طريق إضافة 20 مل من كاشف الاسترجاع المستهدف 10X إلى 180 مل من الماء. ضع حاملي شرائح في قدر بخاري.
املأ حامل شريحة واحد ب 200 مل من كاشف استرجاع الهدف 1X والآخر ب 200 مل من الماء. باستخدام القدر البخاري ، سخني كلا المحاللين حتى يغلي. قم بتسخين محلول الغسيل 50X إلى 40 درجة مئوية لمدة 10 إلى 20 دقيقة.
ثم قم بإعداد ثلاثة لترات من المخزن المؤقت للغسيل 1X عن طريق تخفيف 60 مل من محلول الغسيل 50X الدافئ مسبقا مع 2.94 لتر من الماء. في غطاء الدخان ، قم بإعداد 50٪ من محلول هيماتوكسيلين المضاد للتلطيخ من جيل عن طريق إضافة 100 مل من هيماتوكسيلين جيل إلى 100 مل من الماء. قم بإعداد كاشف أزرق عن طريق إضافة 1.43 مل من 20 إلى 30٪ هيدروكسيد الأمونيوم إلى 250 مل من الماء.
قمبتسخين المجسات المستهدفة مسبقا عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل تهجين المسبار. أحضر الكواشف السبعة المكبرة ، أمبير 0 إلى 6 ، إلى درجة حرارة الغرفة. ابدأ إزالة العينة عن طريق إزالة الأقسام من الفرن وغمر شرائح الأنسجة المثبتة في الزيلين مع التحريك لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة الباريفين مرة أخرى في الزيلين الطازج لمدة خمس دقائق. يجفف في 100٪ إيثانول مع التحريض لمدة دقيقتين. وكرر مرة أخرى في الإيثانول الطازج 100٪ لمدة دقيقتين.
جفف الشرائح بالهواء على حرارة 60 درجة مئوية في فرن هواء دائري لمدة خمس دقائق حتى تجف تماما. بعد ذلك ، احتضان الأقسام بحوالي أربع قطرات من بيروكسيد الهيدروجين الجاهز للاستخدام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لإخماد نشاط البيروكسيديز الداخلي. صب المحلول من الشرائح وشطفها مرتين بالماء.
اغمس الأقسام لفترة وجيزة في الماء الدافئ مسبقا ثم ضع الأقسام في 200 مل من كاشف الاسترجاع المستهدف عند 100 درجة مئوية في القدر البخاري لمدة 15 إلى 30 دقيقة. قم بإزالة الشرائح من الاسترجاع المستهدف واشطفها مرتين بالماء. اغمس في 100٪ إيثانول لمدة ثلاث دقائق.
ثم جفف الشرائح على حرارة 60 درجة مئوية في فرن هواء دائري حتى تجف تماما. بمجرد أن تجف الشرائح ، استخدم قلما كارها للماء لرسم حاجز كاره للماء بحجم 0.75 × 0.75 بوصة تقريبا حول القسم. دع الحاجز يجف تماما في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
ضع الشرائح في حامل الشرائح وضع حامل الشريحة في الدرج الذي تم تسخينه مسبقا للتحكم في الرطوبة. أضف حوالي أربع قطرات من البروتياز 3 إلى كل شريحة واحتضن على حرارة 40 درجة مئوية في فرن التهجين لمدة 15 إلى 30 دقيقة. صب المحلول من الشرائح وشطفها مرتين بالماء.
لبدء إجراء تهجين المسبار ، أضف حوالي أربع قطرات من محلول المسبار المناسب الجاهز للاستخدام لتغطية القسم بأكمله. قم بتهجين المجسات عند 40 درجة مئوية في فرن التهجين لمدة ساعتين. صب المحلول من الشرائح وغسل الشرائح في 200 مل من مخزن الغسيل 1X في درجة حرارة الغرفة مع التحريك العرضي لمدة دقيقتين.
كرر إجراء الغسيل. الخطوة التالية هي تضخيم الإشارة عن طريق احتضان الأقسام في سلسلة من الكواشف المضخمة. أضف حوالي أربع قطرات من أمبير 0 لتغطية القسم بأكمله في كل شريحة واحتضانها عند 40 درجة مئوية في فرن التهجين لمدة 30 دقيقة.
ثم صب المحلول وغسل الشرائح في 200 مل من عازلة الغسيل 1X في درجة حرارة الغرفة مع التحريك العرضي لمدة دقيقتين. كرر إجراء الغسيل. بنفس الطريقة ، احتضان الأقسام في Amp 1 إلى Amp 6 عند درجة الحرارة ومقدار الوقت الموضح في هذا المخطط.
بعد معالجة الشرائح بسلسلة من كواشف التضخيم ، قم بإعداد محلول عمل صبغة أحمر سريع. أضف الحجم المناسب من صبغة Fast Red-B وصبغة Fast Red-A في أنبوب واخلطها جيدا. صب السائل الزائد من الشرائح وأضف محلول عمل صبغة Fast Red إلى الشرائح.
احتضن الشرائح في صينية بغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، صب محلول Fast Red واشطف الشرائح مرتين عن طريق غمسها لأعلى ولأسفل بماء الصنبور. لمواجهة بقع أقسام الأنسجة ، اغمر الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين من جيل بنسبة 50٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
اغسل الشرائح بماء الصنبور ، وكرر ذلك عدة مرات حتى تصبح الشرائح واضحة بينما تظل الأقسام أرجوانية. اغمس الشرائح في 02٪ ماء الأمونيا مرتين إلى ثلاث مرات للزرق الأزرق. استبدل ماء الأمونيا بماء الصنبور واغسل الشرائح ثلاث إلى خمس مرات.
جفف الشرائح في فرن هواء دائري على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة حتى تجف تماما. ضع قطرة أو قطرتين من كاشف التثبيت على زلة الغطاء وضع الشريحة فوق زلة الغطاء مع تجنب أي محاصرة لفقاعات الهواء. جفف الشرائح في الهواء لمدة خمس دقائق على الأقل.
أخيرا ، راقب الشرائح تحت مجهر المجال الساطع القياسي. تم تصميم مجسات تقاطع exon مزدوجة Z لتحديد حالة EGFRvIII في عينتين من البارافين الثابت للفورمالين ، أو عينة الورم الأرومي الدبقي FFPE. اكتشف كلا المجالسين من النوع البري إشارة في كلتا العينتين ، مما يشير إلى أن العينتين تعبر عن النوع البري EGFR.
ومع ذلك ، اكتشف المسبار المتحور إشارة فقط في العينة الموجبة EGFRvIII وليس في العينة السالبة EGFRvIII. تم تضمين مجسات التحكم الإيجابية والسلبية في المقايس. عندما تم إجراء اختبار هدف قصير على خلايا Jurkat ، المعدة كحبيبات خلية FFPE باستخدام مجسات مضادة للمعنى أو الإحساس ، واستهداف التسلسلات باللون الأحمر ، لوحظ تلطيخ قوي باستخدام مجسات مضادة للمعنى لكل من CDR3-alpha و CDR3-beta ، في حين أن مجسات الإحساس اكتشفت إشارة قليلة أو معدومة.
تم استخدام dapB كعنصر تحكم سلبي. الاختبار قادر أيضا على اكتشاف الطفرات النقطية. في هذا المثال ، تم تصميم مسبارين ، أحدهما للكشف عن تسلسل EGFR المتحور L858R والآخر للكشف عن تسلسل النوع البري EGFR L858.
اكتشفالمسبار المتحور إشارة في خط الخلية H1975 ، وهو متغاير الزيجوت لطفرة EGFR L858R ، لكنه لم يكتشف إشارة في خط خلية H2229 ، والذي يعبر فقط عن النوع البري EGFR L858. اكتشف المسبار من النوع البري إشارة في كلا خطي الخلية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إصلاح أنسجتك بشكل صحيح ، وتشغيل مجسات التحكم الإيجابية والسلبية ، واستخدام نظام معالجة الشرائح في فرن التهجين.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل IHC مع علامات الخلايا من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد التعبير المحدد لنوع الخلية لمتغيرات لصق أو التسلسلات المستهدفة القصيرة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في علم الأعصاب والأورام وما بعدها لاستكشاف أحداث التضفير البديلة في سياق الأنسجة ، وتحديد طفرات النقاط المعينة مكانيا ، وتصور التسلسلات المتجانسة والقصيرة للغاية في الموقع. لا تنس أن العمل مع الفورمالين والزيلين المحايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في غطاء الدخان وارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة هجينة في الموقع تتيح الكشف الحساس والمحدد عن تسلسلات الحمض النووي الريبي القصيرة مثل 50 نيوكليوتيد على مستوى الخلية الواحدة. يمكن تطبيق الطريقة في مجالات متنوعة، بما في ذلك علم الأعصاب وعلم الأورام، مما يسهل تصور المتغيرات المتقطعة والطفرات ضمن سياقات الأنسجة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأورام
- علم الأحياء الجزيئي
الخلفية
- التهجين في الموقع هي تقنية قوية لدراسة التعبير الجيني.
- تسمح الدقة على مستوى الخلية الواحدة بتحليل مفصل للتغاير الخلوي.
- الكشف عن المتغيرات المتقطعة والطفرات أمر بالغ الأهمية لفهم آليات المرض.
- يمكن إجراء الفحص يدويًا أو تلقائيًا، مما يزيد من سهولة الوصول إليه.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة لاكتشاف تسلسلات الحمض النووي الريبي القصيرة بحساسية عالية.
- لتمكين تصور أنماط التعبير الجيني في عينات الأنسجة.
- تسهيل البحث حول التعبير الخاص بنوع الخلية في سياقات بيولوجية مختلفة.
الطرق المستخدمة
- تحضير عينات الأنسجة باستخدام تثبيت الفورمالين وتضمين البارافين.
- تقسيم الأنسجة إلى شرائح رقيقة للتهجين.
- استخدام كواشف استعادة الهدف ومسبارات التهجين.
- تضخيم الإشارات باستخدام سلسلة من الكواشف لتعزيز الكشف.
النتائج الرئيسية
- نجح الفحص في اكتشاف وصلات الإكسونات والطفرات النقطية.
- تم تحقيق خصوصية وحساسية عالية في التحليلات على مستوى الخلية الواحدة.
- تم تصور المتغيرات المتقطعة في أنسجة الدماغ والأورام.
- أظهرت الطريقة إمكانية التطبيقات الأوسع في مجالات بحثية متنوعة.
الاستنتاجات
- تعتبر طريقة التهجين في الموقع هذه أداة قيّمة لأبحاث علم الأحياء الجزيئي.
- توفر رؤى حول التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة.
- يمكن أن تساعد التقنية في فهم العمليات البيولوجية المعقدة والأمراض.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate detection of RNA biomarkers in their native tissue context is critical for target validation and biomarker-driven drug development in oncology and neuroscience. This RNA in situ hybridization assay enables sensitive and specific visualization of splice variants, short sequences, and point mutations at single-cell resolution, supporting mechanistic de-risking and translational biomarker alignment. By preserving spatial information lost in grind-and-bind methods, it enhances predictive confidence in preclinical target selection and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing exon junction-specific splice variants like EGFRvIII and METΔ14 in tissue context.
- Operational Value: Provides single-cell resolution data to clarify pathway activation and cellular heterogeneity in tumor microenvironments.
- Scientific Value: Supports functional target validation by distinguishing mutant from wild-type alleles at single-nucleotide resolution (e.g., EGFR L858R, KRAS G12A).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Detects RNA targets as short as 50 nucleotides, enabling CDR3 sequence profiling in immune repertoires for immuno-oncology target discovery.
- Operational Value: Compatible with automated staining platforms, supporting assay standardization and scalability across preclinical programs.
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts that aid in assay optimization and reproducibility assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through detection of clinically actionable variants in FFPE glioblastoma and cell line models.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by maintaining morphological context during molecular analysis.
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment by linking genetic variants to cellular phenotypes in tissue sections.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly where spatial validation of genetic alterations informs target confidence and de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of splice variant functionality and mutation impact in native tissue architecture.
- Screening: Enables preparation of validated biological systems for downstream compound screening via spatially resolved target confirmation.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell measurements of RNA variants that help compare experimental conditions and allelic ratios.
- Translational Research: Connects molecular findings to histopathological context, supporting biomarker-driven patient stratification models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for longitudinal monitoring of target expression across models and therapeutic interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from bulk RNA methods.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized protocols compatible with manual and automated workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved evidence of target engagement and variant prevalence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on co-expression with phenotypic markers in tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, molecular pathology, and nucleic acid hybridization techniques.
- Dependent on access to hybridization ovens, slide processing systems, and automated stainers for high-throughput use.
- Necessitates cross-team standardization between histology, molecular biology, and bioinformatics for consistent probe design and data interpretation.
- Must account for tissue fixation variables (e.g., formalin penetration time) that may affect accessibility of short or structured RNA targets.
- Limited by target availability; efficacy depends on probe specificity and accessibility of epitopes in FFPE sections.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Tissue Preparation
1:30
Equipment and Reagent Preparation
3:24
Sample Deparaffinization, Dehydration, and Pre-treatment
5:26
Probe Hybridization, Signal Amplification, and Detection
7:18
Counterstaining, Slide Mounting, and Visualization
8:18
Results: Detection of Splice Variants, Short Sequences, and Point Mutation In Situ
10:00
Conclusion
