تصور المتغيرات الجينية وأهداف قصيرة والطفرات في سياق الأنسجة المورفولوجية الجيش النيبالي الملكي في الموقع تهجين المقايسة

يمكن أن تعالج هذه الطريقة أسئلة البحث الرئيسية في علم الأعصاب والأورام وما بعدها ، مثل التعبير المحدد لنوع الخلية ورسم الخرائط المكانية لمتغيرات لصق داخل الدماغ والبيئات الدقيقة للورم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تكتشف تقاطعات exon والتسلسلات القصيرة والطفرات النقطية في سياق الأنسجة بحساسية وخصوصية عالية جدا في الخلايا المفردة. سيوضح الإجراء Hell Pimentel ، وهو عالم مشارك من مختبرنا.

لتحضير الأنسجة ، قم بإصلاحها مباشرة بعد التشريح في الفورمالين المحايد المخزن بنسبة 10٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 إلى 32 ساعة. بعد ذلك ، تتم معالجة العينة وتضمينها في البارافين باستخدام الإجراءات القياسية. قم بتقطيع الأنسجة المضمنة إلى خمسة أقسام زائد أو ناقص ميكرون واحد باستخدام ميكروتوم.

قم بتركيب الأقسام على شرائح زجاجية لاصقة إلكتروستاتيكية وجففها في الهواء في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. قبل ساعة واحدة من إجراء فحص تهجين RNA NC2 ، ضع شرائح الأنسجة المثبتة في رف منزلق واخبزها في فرن هواء دائري على حرارة 60 درجة مئوية. قبل بدء مقايسة تهجين RNA NC2 ، تأكد من ضبط فرن التهجين على 40 درجة مئوية.

بلل ورق الترطيب جيدا ، وقم بإزالة أي ماء متبقي ، وضع الغطاء على درج التحكم في الرطوبة. قم بإعداد 200 مل من كاشف استرجاع الهدف 1X المتاح تجاريا عن طريق إضافة 20 مل من كاشف الاسترجاع المستهدف 10X إلى 180 مل من الماء. ضع حاملي شرائح في قدر بخاري.

املأ حامل شريحة واحد ب 200 مل من كاشف استرجاع الهدف 1X والآخر ب 200 مل من الماء. باستخدام القدر البخاري ، سخني كلا المحاللين حتى يغلي. قم بتسخين محلول الغسيل 50X إلى 40 درجة مئوية لمدة 10 إلى 20 دقيقة.

ثم قم بإعداد ثلاثة لترات من المخزن المؤقت للغسيل 1X عن طريق تخفيف 60 مل من محلول الغسيل 50X الدافئ مسبقا مع 2.94 لتر من الماء. في غطاء الدخان ، قم بإعداد 50٪ من محلول هيماتوكسيلين المضاد للتلطيخ من جيل عن طريق إضافة 100 مل من هيماتوكسيلين جيل إلى 100 مل من الماء. قم بإعداد كاشف أزرق عن طريق إضافة 1.43 مل من 20 إلى 30٪ هيدروكسيد الأمونيوم إلى 250 مل من الماء.

بتسخين المجسات المستهدفة مسبقا عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل تهجين المسبار. أحضر الكواشف السبعة المكبرة ، أمبير 0 إلى 6 ، إلى درجة حرارة الغرفة. ابدأ إزالة العينة عن طريق إزالة الأقسام من الفرن وغمر شرائح الأنسجة المثبتة في الزيلين مع التحريك لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة الباريفين مرة أخرى في الزيلين الطازج لمدة خمس دقائق. يجفف في 100٪ إيثانول مع التحريض لمدة دقيقتين. وكرر مرة أخرى في الإيثانول الطازج 100٪ لمدة دقيقتين.

جفف الشرائح بالهواء على حرارة 60 درجة مئوية في فرن هواء دائري لمدة خمس دقائق حتى تجف تماما. بعد ذلك ، احتضان الأقسام بحوالي أربع قطرات من بيروكسيد الهيدروجين الجاهز للاستخدام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لإخماد نشاط البيروكسيديز الداخلي. صب المحلول من الشرائح وشطفها مرتين بالماء.

اغمس الأقسام لفترة وجيزة في الماء الدافئ مسبقا ثم ضع الأقسام في 200 مل من كاشف الاسترجاع المستهدف عند 100 درجة مئوية في القدر البخاري لمدة 15 إلى 30 دقيقة. قم بإزالة الشرائح من الاسترجاع المستهدف واشطفها مرتين بالماء. اغمس في 100٪ إيثانول لمدة ثلاث دقائق.

ثم جفف الشرائح على حرارة 60 درجة مئوية في فرن هواء دائري حتى تجف تماما. بمجرد أن تجف الشرائح ، استخدم قلما كارها للماء لرسم حاجز كاره للماء بحجم 0.75 × 0.75 بوصة تقريبا حول القسم. دع الحاجز يجف تماما في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

ضع الشرائح في حامل الشرائح وضع حامل الشريحة في الدرج الذي تم تسخينه مسبقا للتحكم في الرطوبة. أضف حوالي أربع قطرات من البروتياز 3 إلى كل شريحة واحتضن على حرارة 40 درجة مئوية في فرن التهجين لمدة 15 إلى 30 دقيقة. صب المحلول من الشرائح وشطفها مرتين بالماء.

لبدء إجراء تهجين المسبار ، أضف حوالي أربع قطرات من محلول المسبار المناسب الجاهز للاستخدام لتغطية القسم بأكمله. قم بتهجين المجسات عند 40 درجة مئوية في فرن التهجين لمدة ساعتين. صب المحلول من الشرائح وغسل الشرائح في 200 مل من مخزن الغسيل 1X في درجة حرارة الغرفة مع التحريك العرضي لمدة دقيقتين.

كرر إجراء الغسيل. الخطوة التالية هي تضخيم الإشارة عن طريق احتضان الأقسام في سلسلة من الكواشف المضخمة. أضف حوالي أربع قطرات من أمبير 0 لتغطية القسم بأكمله في كل شريحة واحتضانها عند 40 درجة مئوية في فرن التهجين لمدة 30 دقيقة.

ثم صب المحلول وغسل الشرائح في 200 مل من عازلة الغسيل 1X في درجة حرارة الغرفة مع التحريك العرضي لمدة دقيقتين. كرر إجراء الغسيل. بنفس الطريقة ، احتضان الأقسام في Amp 1 إلى Amp 6 عند درجة الحرارة ومقدار الوقت الموضح في هذا المخطط.

بعد معالجة الشرائح بسلسلة من كواشف التضخيم ، قم بإعداد محلول عمل صبغة أحمر سريع. أضف الحجم المناسب من صبغة Fast Red-B وصبغة Fast Red-A في أنبوب واخلطها جيدا. صب السائل الزائد من الشرائح وأضف محلول عمل صبغة Fast Red إلى الشرائح.

احتضن الشرائح في صينية بغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، صب محلول Fast Red واشطف الشرائح مرتين عن طريق غمسها لأعلى ولأسفل بماء الصنبور. لمواجهة بقع أقسام الأنسجة ، اغمر الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين من جيل بنسبة 50٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.

اغسل الشرائح بماء الصنبور ، وكرر ذلك عدة مرات حتى تصبح الشرائح واضحة بينما تظل الأقسام أرجوانية. اغمس الشرائح في 02٪ ماء الأمونيا مرتين إلى ثلاث مرات للزرق الأزرق. استبدل ماء الأمونيا بماء الصنبور واغسل الشرائح ثلاث إلى خمس مرات.

جفف الشرائح في فرن هواء دائري على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة حتى تجف تماما. ضع قطرة أو قطرتين من كاشف التثبيت على زلة الغطاء وضع الشريحة فوق زلة الغطاء مع تجنب أي محاصرة لفقاعات الهواء. جفف الشرائح في الهواء لمدة خمس دقائق على الأقل.

أخيرا ، راقب الشرائح تحت مجهر المجال الساطع القياسي. تم تصميم مجسات تقاطع exon مزدوجة Z لتحديد حالة EGFRvIII في عينتين من البارافين الثابت للفورمالين ، أو عينة الورم الأرومي الدبقي FFPE. اكتشف كلا المجالسين من النوع البري إشارة في كلتا العينتين ، مما يشير إلى أن العينتين تعبر عن النوع البري EGFR.

ومع ذلك ، اكتشف المسبار المتحور إشارة فقط في العينة الموجبة EGFRvIII وليس في العينة السالبة EGFRvIII. تم تضمين مجسات التحكم الإيجابية والسلبية في المقايس. عندما تم إجراء اختبار هدف قصير على خلايا Jurkat ، المعدة كحبيبات خلية FFPE باستخدام مجسات مضادة للمعنى أو الإحساس ، واستهداف التسلسلات باللون الأحمر ، لوحظ تلطيخ قوي باستخدام مجسات مضادة للمعنى لكل من CDR3-alpha و CDR3-beta ، في حين أن مجسات الإحساس اكتشفت إشارة قليلة أو معدومة.

تم استخدام dapB كعنصر تحكم سلبي. الاختبار قادر أيضا على اكتشاف الطفرات النقطية. في هذا المثال ، تم تصميم مسبارين ، أحدهما للكشف عن تسلسل EGFR المتحور L858R والآخر للكشف عن تسلسل النوع البري EGFR L858.

المسبار المتحور إشارة في خط الخلية H1975 ، وهو متغاير الزيجوت لطفرة EGFR L858R ، لكنه لم يكتشف إشارة في خط خلية H2229 ، والذي يعبر فقط عن النوع البري EGFR L858. اكتشف المسبار من النوع البري إشارة في كلا خطي الخلية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إصلاح أنسجتك بشكل صحيح ، وتشغيل مجسات التحكم الإيجابية والسلبية ، واستخدام نظام معالجة الشرائح في فرن التهجين.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل IHC مع علامات الخلايا من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد التعبير المحدد لنوع الخلية لمتغيرات لصق أو التسلسلات المستهدفة القصيرة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في علم الأعصاب والأورام وما بعدها لاستكشاف أحداث التضفير البديلة في سياق الأنسجة ، وتحديد طفرات النقاط المعينة مكانيا ، وتصور التسلسلات المتجانسة والقصيرة للغاية في الموقع. لا تنس أن العمل مع الفورمالين والزيلين المحايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في غطاء الدخان وارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.