توصيف وظيفي من كاربوكسيليستيراسيس في البيت مقاومة المبيدات الحشرية الذباب و الذبابة مستأنسة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الأسئلة الرئيسية في مجال علم السموم الحشرية ، مثل ، إذا كانت جميع جينات إزالة السموم الأيضية متورطة في مقاومة المبيدات الحشرية؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بإنتاج مقاييس أكبر من البروتينات ، وتوصيف وظيفة هذه البروتينات في استقلاب المبيدات الحشرية في المختبر. يوضح الإجراءات ، Xuechun Feng ، طالب دراسات عليا في مختبري.

تركز أبحاث الدكتوراه في Xuechen على توصيف وظيفة الكربوكسيل إستيراز في مقاومة الطفيليات للذباب المنزلي ، Musca domestica. للبدء ، امزج ميكرولتر واحد من الحمض النووي لبلازما دخول GFP ، مع خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الخطي C المتاح تجاريا في أنابيب PCR سعة 250 ميكرولترا. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من مزيج إعادة تركيب لامدا المتاح تجاريا إلى كل أنبوب من أنابيب PCR.

امزج الأنابيب برفق واحتضانها عند 25 درجة مئوية طوال الليل. بذور ملليلترين من زراعة خلايا الحشرات SF9 في مرحلة السجل بالتساوي إلى آبار لوحة زراعة الخلايا. ثم اسمح للخلايا بالالتصاق لمدة ثلاث ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة ، في الغطاء.

باستخدام مجهر الطور المقلوب عند 250 ضعفا ، تحقق من مرفق الخلية. ثم قم بإزالة وسط زراعة الخلية ، واستبدله بملليلترين من وسط حشرات جريس. بعد ذلك ، قم بإعداد محاليل خليط التعداء A و B وفقا لبروتوكول النص.

ثم اخلطي مخاليط الإرسال A و B معا برفق عن طريق النقر على الأنابيب. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة ، في الغطاء ، لمدة 35 دقيقة. بعد ذلك ، أضف الخليط على الخلايا المصنفة.

أغلق الآبار بشريط لاصق ، واحتضن الخلايا عند 27 درجة مئوية طوال الليل. استبدل ملليلترين من وسط حشرات جريس ، بملليلترين من وسط النمو الكامل. ثم أضف 100 ميكرومول جانسيكلوفير إلى كل بئر.

أغلق الآبار بشريط لاصق ، واحتضان الخلايا عند 27 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. بعد 72 ساعة من الإصابة ، اجمع الوسط من كل بئر ، وانقله إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر. ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 1500 مرة G، لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

أضف ملليلترا واحدا من وسط النمو الكامل إلى البئر ، واستخدم مجهرا بضوء الفلورسنت ، لمراقبة علامات العدوى للخلايا في مرحلة تضخيم الفيروس العصبي P1. انقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية ، في ظروف مظلمة. بعد ذلك ، قم بزرع ملليلترين من نمو الحشرات في مرحلة السجل SF9 لزراعة الخلايا ، بالتساوي ، في آبار لوحة زراعة الخلايا.

اسمح للخلايا بالالتصاق لمدة ثلاث ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة ، في الغطاء. قم بتلقيح خمسة ميكرولترات من مخزون فيروس P1 في الآبار المصنفة الخلوية ، ثم أضف 100 ميكرومول جانسيكلوفير إلى كل بئر. أغلق الآبار واحتضان الخلايا لمدة 72 ساعة عند 27 درجة مئوية.

أولا ، استزراع خمسة ملليلتر من خلايا الحشرة SF9 لنمو المرحلة اللوغاريتمية ، مع وسط نمو كامل ، في قوارير T25 غير المعالجة. ثم أضف 25 ميكرولترا من محلول مخزون فيروس P1 لإصابة مزرعة الخلية لمدة 48 ساعة مع رج لطيف عند 27 درجة مئوية. باستخدام الأسيتونيتريل ، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية من 100 ملليمول بيرميثرين.

بعد ذلك ، قم بزرع 200 ميكرولتر من زراعة الخلايا المصابة مع 300 ميكرولتر من وسط النمو الكامل ، في صفيحة 24 بئر. التأكد من إذابة البيرميثرين بالكامل في الأسيتونيتريل ، وتوصيله بالتساوي في كل بئر من اللوحة. بعد إضافة البيرميثرين ، رج الطبق برفق لخلط البيرميثرين بالكامل في الوسط.

بعد ذلك ، أغلق اللوحة بشريط لاصق ، واحتضن اللوحة عند 27 درجة مئوية ، لمدة 48 ساعة ، في الظروف المظلمة. قم بإزالة وسط زراعة الخلية من اللوحة دون إزعاج طبقة الخلية السفلية المرفقة. أضف 200 ميكرولتر من كاشف MMT إلى كل بئر.

ثم احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات ، حتى تتشكل رواسب فورمازان أرجوانية داكنة في كل بئر. أضف 500 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر لإذابة المرسبات بالكامل. ثم انقل 200 ميكرولتر من المحلول المذاب إلى كل بئر من لوح 96 بئر.

يعد إذابة الراسب بالكامل إلى DMSO أمرا بالغ الأهمية لدقة النتائج. بعد إضافة DMSO إلى العينات الموجودة في اللوحة ، سيتم غسل العينات باستخدام الماصة ، لعدة مرات ، حتى يتم إذابة الراسب بالكامل. أخيرا ، استخدم قارئ صفيحة دقيقة لقياس قيم امتصاص اللوحة عند 540 نانومتر.

في مرحلة P1 ، تكون نسبة الإصابة منخفضة. في مرحلة P2 ، تم تحسين نسبة الإصابة بشكل كبير. في مرحلة عدوى P3 ، أظهرت جميع الخلايا تقريبا أعراض الانفصال عن لوحة زراعة الخلية ، وزيادة قطر الخلية ، وكذلك توقف نمو الخلايا.

بناء على قيم الامتصاص المكتشفة ، أظهرت الخلايا التي تعبر عن Md alpha E7 قابلية أعلى بكثير للبقاء ، مقارنة بخلايا التحكم في CAT. أثناء إجراء هذا الإجراء ، من المهم منع تلوث الخلايا في جميع الخطوات ، عن طريق مسح سطح المواد ، مثل الزجاجات والأنابيب ، بنسبة 70 في المائة من الإيثانول قبل إجراء تجارب الخلية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء بعض الطرق الأخرى ، مثل نمذجة التماثل والتحليل المظلم ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل التفاعلات بين بروتين كربوكسيل إستيراز ورابطة البيرميثرين.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في علم سموم الحشرات ، لاستكشاف التوصيف الوظيفي للجينات والآليات في مقاومة المبيدات الحشرية للحشرات. لا تنس أن العمل مع المبيدات الحشرية يمكن أن يكون ضارا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل القفازات ومعاطف المختبر ، أثناء إجراء هذه الإجراءات.