قياس لوني سائل عالي الأداء كينورينيني وحمض كينورينيك: الكيمياء الحيوية المتعلقة بالإدراك والنوم في الفئران

تجمع هذه الطريقة بين الأساليب البيوكيميائية والسلوكية للمساعدة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب حول تأثير تحدي الكينورينين الحاد في الفئران. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر طريقة موثوقة ومتسقة لقياس مستقلبات مسار الكينورنين في دماغ الفئران والبلازما. ستظهر الإجراء كارلي فابيان ، مساعدة باحثة طلابية من مختبري.

في نقطة النهاية التجريبية المناسبة بعد إعطاء الكينورنين داخل الصفاق ، قم بإذابة البلازما المحصودة المجمدة على الجليد الرطب وتخفيف العينات المذابة بالماء عالي النقاء. نقل 100 ميكرولتر من العينة المخففة إلى حاويات فردية سعة 25 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 6٪ والدوامة في أجهزة الطرد المركزي للعينات. بعد ذلك ، قم بنقل 100 ميكرولتر من المواد الطافية من كل أنبوب إلى أنابيب فردية من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 250 ميكرولتر لتحديد حمض الكينورينيك وحمض الكينورينيك.

لقياس حمض الكينورينيك من عينات الدماغ ، قم بإذابة عينات الدماغ المجمدة التي تم حصادها على الجليد الجاف ووزن كل عينة بشكل فردي على ميزان تحليلي دقيق. عندما يتم وزن جميع العينات ، انقل الأنابيب إلى الثلج الرطب وقم بتخفيف كل عينة من الأنسجة بنسبة وزن واحد إلى 10 بحجم بماء فائق النقاء ، متبوعا بالتجانس باستخدام مكبر صوت. Aliquot 100 ميكرولتر من كل ملاط عينة إلى أنبوب جديد ثم أضف 25 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 25٪ للدوامة والطرد المركزي.

بعد ذلك ، قم بنقل 100 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنابيب فردية للطرد المركزي الدقيق سعة 250 ميكرولتر لتحديد حمض الكينورينيك. لإعداد آلة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ، أو HPLC ، لتحليل الكينورينين ، ضع أولا أنابيب سحب HPLC الفردية في المرحلة المتنقلة والمياه عالية النقاء وحاويات الأسيتونيتريل بنسبة 100٪. بعد ذلك ، قم ببرمجة الجهاز لتشغيل 5٪ أسيتونيتريل و 95٪ ماء فائق النقاء بمعدل 0.5 مل في الدقيقة واسمح لآلة HPLC بالعمل لمدة 20 إلى 30 دقيقة.

عندما يتم تحقيق ضغط مستقر وخط أساس ، قم بتغيير تركيبة المحلول إلى طور متحرك بنسبة 5٪ أسيتونيتريل و 95٪ أسيتات الصوديوم وقم بموازنة الجهاز لمدة 30 دقيقة أخرى. أثناء توازن الجهاز ، قم بتشغيل المصباح في كاشف التألق. قبل الاشتقاق ، قم بضخ محلول أسيتات الزنك بشكل منفصل من خلال مضخة تمعجية تتحد مع عمود آخر الطور المتحرك وقم بتشغيل مضخة عمود العمود بمعدل تدفق يبلغ 0.1 مل في الدقيقة لمدة 20 دقيقة تقريبا ، حتى تصل إلى ضغط مستقر يبلغ حوالي 500 رطل لكل بوصة مربعة.

عندما تكون الأداة جاهزة للتحليل ، اضبط برنامج النظام للتحكم في معلمات تسلسل العينة والسماح بالحقن التلقائي لعينات متعددة. في شاشة تشغيل العينة، انقر فوق ملف، واسحب لأسفل لإنشاء مجموعة نماذج جديدة'تحديد فارغ'في النافذة الجديدة. قم بإدراج جميع المعايير والعينات بشكل فردي بالترتيب الذي يجب تشغيله ، مع فحص المعايير في بداية التسلسل ونهايته.

في عمود الوظيفة ، قم بتعيين المعايير والعينات وقم بتعيين البرنامج لحقن الماء بين كل خمس عينات. اضبط وقت التشغيل لكل عينة على 15 دقيقة وحقن 20 ميكرولترا من العينات من المعايير ، متبوعا ب 20 ميكرولترا من عينات البلازما و 30 ميكرولترا من عينات الدماغ المتجانسة حسب الاقتضاء تجريبيا. بعد ذلك ، قم بتعيين الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث وفقا للمركب الذي يتم قياسه وقم بتشغيل التسلسل.

لتحديد البيانات كميا ، افتح شاشة استعراض المشروع وتحت علامة التبويب مجموعات العينات ، انقر نقرا مزدوجا فوق مجموعة العينة ليتم تحديدها كميا. من قائمة الحقن, قم بتمييز جميع المعايير وانقر بزر الماوس الأيمن لتحديد عملية'في النافذة الجديدة. بعد ذلك ، استخدم القائمة المنسدلة لتحديد "المعايرة والكمية" قم بتمييز جميع المعايير مرة أخرى ، وانقر بزر الماوس الأيمن وحدد "مراجعة" عند فتح الكروماتوگرام ، قم بدمج ومعايرة كل معيار لإنشاء المنحنى القياسي.

بعد ذلك ، ارجع إلى علامة التبويب مجموعات العينات وانقر نقرا مزدوجا فوق مجموعة العينة لقياس الكمية والمراجعة كما هو موضح ، ودمج كل عينة وتحديدها كميا لإخراج تركيز كل عينة بناء على المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه مسبقا. يكشف تحليل HPLC لعينات الأنسجة التي تم حصادها من التي يتم تناولها من الكينورينين عن وقت احتفاظ بالكينورينين يبلغ حوالي ست دقائق ووقت احتفاظ بحمض الكينورينيك حوالي 11 دقيقة. يكشف القياس الكمي للبلازما كينورينين وحمض الكينورينيك الحصين أن حقن الكينورينين الحاد يزيد من مستويات حمض الكينورينيك في الدماغ مع ذروة تتحقق بعد ساعتين من الحقن وتعود إلى خط الأساس بعد أربع ساعات من الحقن.

على الرغم من عدم ملاحظة أي اختلافات في المجموعة أثناء تجارب التدريب على نموذج التجنب السلبي ، إلا أن التحكم تظهر زيادة كبيرة في زمن الوصول لدخول الجانب المظلم أثناء تجارب الاختبار ، مما يشير إلى التعلم السياقي ، في حين أن التي تم حقنها بالكينورينين قبل 24 ساعة لا تظهر نفس الزيادة في زمن الوصول ، مما يدل على وجود عجز في التعلم. علاوة على ذلك ، يشير تقييم تأثير ارتفاع الكينورنين الحاد أثناء المرحلة الخفيفة على بنية النوم والاستيقاظ إلى انخفاض في إجمالي مدة نوم حركة العين السريعة خلال الساعتين الأوليين بعد حقن الكينورينين. تنعكس هذه البيانات من خلال زيادة مدة الاستيقاظ خلال هذه الفترات الزمنية وانخفاض طفيف في نوم حركة العين غير السريعة ، مما يدل على أن ارتفاع الكينورنين الحاد يسبب أيضا اضطرابات في ديناميكيات النوم والاستيقاظ.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحليل السلوكي للإجابة على أسئلة إضافية حول دور تكوين حمض الكينورينيك المرتفع في تعديل الإدراك والنوم.