في المختبر إعادة تشكيل التنظيم الذاتي أنماط البروتين في بليرس الدهن المعتمدة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تنظيم الخلية والأغشية ، على سبيل المثال ، الدور الذي تلعبه الإشارات الهندسية في العملية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتحكم الدقيق في جميع الجوانب التي تؤثر على تكوين الأنماط ، مثل تركيزات البروتين. للبدء ، قم بإنشاء حويصلات متعددة الصفائح كما هو موضح في بروتوكول النص.

الآن ، قم بتجميد الدهون وإذابة الثلج لمدة سبع إلى 10 دورات ، عن طريق تحضير دورق بالماء أولا عند 70 إلى 99 درجة مئوية على صفيحة ساخنة ، بالإضافة إلى وعاء يحتوي على النيتروجين السائل. امسك القارورة في النيتروجين السائل بملاقط كبيرة حتى يتوقف النيتروجين عن الغليان. ثم انقل القارورة إلى الماء الساخن حتى يذوب المحلول تماما.

كرر هذه الخطوات حتى يظهر خليط الدهون واضحا للعين ، اعتمادا على الخليط. بعد ذلك ، قم بتجميع آلة بثق الدهون وشطف النظام مسبقا باستخدام Min buffer. قم بثق خليط الدهون بين 35 و 41 مرة من خلال غشاء بحجم المسام 50 نانومتر.

تأكد من الانتهاء بعدد فردي من التمريرات لتجنب الركام الذي لم يجتاز الغشاء أبدا. قم بتوزيع الأغطية الزجاجية على طبق بتري زجاجي مقلوب أو أي سطح خامل آخر. باستخدام ماصة زجاجية ، أضف سبع قطرات من حمض الكبريتيك المركز إلى وسط كل غطاء.

ثم أضف قطرتين من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 50٪ إلى منتصف قطرات الحمض. غطي التفاعل واحتضانه لمدة 45 دقيقة على الأقل. الآن ، التقط الغطاء بشكل فردي باستخدام ملاقط واشطف الحمض بالماء عالي النقاء.

ضع أغطية المغسولة في حوامل غير لاصقة أو جهاز نقل مشابه. الآن اشطف كل غطاء على نطاق واسع بالماء عالي النقاء وجفف السطح بالغاز المضغوط. ضع علامة على الجانب النظيف من الغطاء بعلامة دائمة.

لتجميع الغرفة ، قم أولا بقطع الغطاء والجزء المخروطي من أنبوب تفاعل 0.5 مليلتر بمقص حاد والتخلص منه. ثم ضع غراء الأشعة فوق البنفسجية على الحافة العلوية للأنبوب ووزع الغراء بالتساوي باستخدام طرف ماصة. قم بلصق الأنبوب رأسا على عقب على الجانب النظيف من الغطاء.

أخيرا ، قم بمعالجة غراء الأشعة فوق البنفسجية عن طريق وضع غرف متعددة تحت مصباح 360 نانومتر أو مصباح LED لمدة خمس إلى 15 دقيقة. لتكوين طبقة ثنائية دهنية مدعومة ، قم بتسخين كتلة حرارية مسبقا إلى 37 درجة مئوية واحتضان أنبوبين من تفاعل المليلتر مع مخزن مؤقت Min أو SLB في أنبوب واحد لكل غرفة. انفخ النيتروجين في الغرف المجمعة والمعالجة لإزالة أي غبار أو جزيئات أخرى قد تكون قد استقرت أثناء المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية وتجميعها.

ثم ضع الغرف على الكتلة الحرارية. قم بتخفيف كمية 20 ميكرولتر من الدهون الصافية مع 130 ميكرولتر من الحد الأدنى من المخزن المؤقت ، مما يؤدي إلى بناء تركيز عمل يبلغ 0.53 ملليغرام لكل ملليلتر. أضف 75 ميكرولترا من خليط الدهون إلى كل حجرة.

الآن ، اضبط المؤقت على ثلاث دقائق. خلال وقت الحضانة ، تنفجر الحويصلات على سطح الزجاج المحب للماء ، وتندمج لتشكيل SLB متماسك. بمجرد مرور 60 ثانية ، أضف 150 ميكرولتر من الحد الأدنى للمخزن المؤقت إلى كل غرفة.

بعد ال 120 ثانية المتبقية ، اغسل كل غرفة بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت Min أو SLB ، وسحب العينات بعناية لأعلى ولأسفل عدة مرات ، وإزالة وإضافة 200 ميكرولتر أخرى. بمجرد غسل كل غرفة مرة واحدة ، استمر في غسل الغرفة الأولى جيدا حتى يتم استخدام ملليلترين من العازلة. يحتاج غسل الطبقات الدهنية المدعومة إلى بعض الخبرة لإتقان مدى الحركات في الغرفة ، والعثور على كثافة الغسيل الصحيحة.

لإنتاج هياكل مجهرية PDMS من رقائق السيليكون المزخرفة ، استخدم أولا كوبا بلاستيكيا لوزن 10 جرامات من قاعدة PDMS وغرام واحد من الرابط المتشابك PDMS. استخدم جهاز خلط لخلط خليط PDMS وتفريغه. الآن ، استخدم طرف الماصة لإسقاط كمية صغيرة من PDMS مباشرة على الهيكل الموجود على رقاقة السيليكون.

ضع على الفور غطاء 1 على قطرة PDMS وخذ الطرف العلوي من طرف الماصة النظيف للضغط برفق على غطاء الغطاء على رقاقة السيليكون. يجب أن ينتشر نظام إدارة المفاتيح الرقمي بشكل رقيق بين الغطاء ورقاقة السيليكون. ضع الرقاقة مع الغطاء في الفرن وقم بمعالجة PDMS لمدة ثلاث إلى أربع ساعات ، أو طوال الليل ، عند 75 درجة مئوية.

بعد ذلك ، أخرج الرقاقة من الفرن واتركها تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. باستخدام شفرة الحلاقة ، قم بإزالة الغطاء بعناية باستخدام PDMS المرفق من رقاقة السيليكون. الآن ، قم بتوصيل غرفة بلاستيكية بنظام PDMS كما هو موضح من قبل للزجاج.

خذ الغطاء مع الحجرة المرفقة وضعه في منظف البلازما مع الأكسجين كغاز العملية. نظف الأغطية بالبلازما. في هذا العمل ، تم استخدام 30٪ من الطاقة و 0.3 ملي بار ضغط الأكسجين لمدة دقيقة واحدة.

الآن ، قم بإعداد SLB في الغرفة كما هو موضح من قبل على الزجاج. لإجراء مقايسة التنظيم الذاتي ، اضبط حجم المخزن المؤقت في الغرفة على 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت Min ، مطروحا منه كمية البروتين ومحلول ATP. ثم أضف MinD ، المسمى MinD ، MinE ، وإذا رغبت في ذلك ، MinC ، واخلط المكونات برفق عن طريق سحب العينات.

الآن ، أضف 2.5 مللي مولار ATP لبدء التنظيم الذاتي ل MinDE. خلال ال 10 إلى 30 دقيقة القادمة ، تحقق من تكوين نمط MinDE المنتظم والهياكل المجهرية المشكلة بشكل صحيح على المجهر الفلوري. عندما تتشكل أنماط MinDE العادية، قم بتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل مرتين لخلط المكونات.

قم بإزالة الجزء الأكبر من المخزن المؤقت باستخدام ماصة سعة 100 ميكرولتر، ثم قم بإزالة الباقي بعناية باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر. للسماح بأوقات تصوير أطول ، قم بتوصيل قطعة إسفنجة مبللة داخل الغرفة. تأكد من أن الإسفنجة لا تلامس سطح الغطاء.

أغلق الغرفة على الفور بغطاء لتجنب تجفيف المخزن المؤقت المتبقي في الهياكل الدقيقة. قبل تصوير الهياكل المجهرية ، تأكد من توقف التنظيم الذاتي MinDE فوق البنية المجهرية PDMS بينما تتأرجح البروتينات الموجودة في التجاويف الدقيقة. في هذا الفيديو التمثيلي ، يوضح التصوير ثنائي اللون كيف يتم تنظيم MinD و MinE ذاتيا في موجات سطحية متنقلة تتوافق مع الأنماط الحلزونية على الطبقات الدهنية الثنائية المدعومة.

هنا ، يظهر التصوير أحادي اللون MinD و MinE يؤديان تذبذبات من قطب إلى قطب في الهياكل المجهرية PDMS. تحدد التذبذبات تدرجا لتركيز MinD بمتوسط زمني مع أقصى تركيز في أقطاب المقصورة والحد الأدنى من التركيز في منتصف المقصورة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى ، مثل تتبع الجسيمات المفردة ، من أجل تحديد حركية ربط الغشاء وأوقات الإقامة.

لا تنس أن العمل باستخدام محلول سمكة البيرانا يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.