أسلوب ثقافة الدانية لدراسة Paracrine الإشارات بين الخلايا

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الاتصالات بين الخلايا حول تفاعلات paracrine المتبادلة مقابل التفاعلات المجاورة بين نوعين من الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تقنية بسيطة للغاية وقابلة للتكرار تلتقط بدقة إشارات paracrine في ظل ظروف الثقافة النموذجية مع منع إشارات التجاور الفعالة في نفس الوقت. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى فهم أفضل لآلية الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية والبيئة الدقيقة للورم.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتفاعلات بين الخلايا السرطانية وسدى الورم ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل التئام الجروح وتكوين الأوعية. ابدأ بفصل خلايا سرطان المبيض من خليط ملتقى بنسبة 80٪ مع مليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين لمدة 40 إلى 60 ثانية ، متبوعا بتحييد التفاعل بستة ملليلتر من وسط النمو الكامل. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط النمو الكامل الطازج.

بعد العد ، قم بتخفيف الخلايا إلى 100،000 خلية سرطان المبيض لكل مليلتر من تركيز وسط النمو الكامل ووضع ثلاثة إدخالات مقلوبة مقلوبة بحجم 0.4 ميكرومتر لزراعة أنسجة البولي كربونات المعالجة لكل حالة تجريبية في طبق زراعة أنسجة معقمة بحجم مناسب. قم بتسمية الإدخالات وفقا للحالة التجريبية وقم بوضع ماصة الخلايا السرطانية بعناية في الجزء السفلي من كل ملحق في دوائر متحدة المركز ، بدءا من منتصف الغشاء والانتقال إلى الخارج لتشكيل قبة سعة 800 ميكرولتر. كن حذرا للغاية عند زرع الخلايا على السطح السفلي للملحق حتى لا تنفد قبة الخلايا المحتوية على الوسط من حواف الملحق أثناء الحضانة.

عندما يتم زرع جميع الإدخالات ، قم بتغطية الطبق وضع الإدخالات بعناية في حاضنة زراعة الخلايا. بعد حوالي أربع ساعات ، افصل HPMC بملليلترين من 0.25٪ تريبسين لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، متبوعا بتحييد التفاعل ب 12 مل من وسط النمو الكامل. اجمع HPMC عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من وسط النمو الكامل للعد.

قم بتخفيف الخلايا إلى 300،000 HPMC لكل مليلتر من وسط النمو الكامل وأضف 2.5 مل من وسط النمو الكامل الطازج إلى كل بئر من صفيحة استزراع من ستة آبار. باستخدام ملقط معقم ، ضع كل جانب يمين لأعلى في كل بئر من الصفيحة المكونة من ستة آبار بحيث يتم غمر الأسطح المتصلة بخلايا سرطان المبيض السفلية في الوسائط. ثم قم بزرع 1.5 مل من HPMC في بئر كل إدراج.

ثم ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 72 ساعة. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة الإدخالات بعناية من كل بئر واشطف جانبي الإدخالات باستخدام PBS. ضع كل ملحق في طبق جديد من ستة آبار وأضف 0.5 مل من التربسين إلى آبار الإدخال ومليلترين من التربسين إلى الآبار السفلية.

بعد دقيقتين عند 37 درجة مئوية ، أضف ملليلترا واحدا من وسط النمو الكامل إلى كل ملحق وقم بماصة المحلول بعناية عدة مرات دون تمزيق الغشاء أو انسكاب تعليق الخلية في البئر أدناه. أثناء سحب العينات، يجب توخي الحذر لمنع التلوث المتبادل للخلايا من غرفة واحدة مع الغرف الأخرى. انقل الخلايا المعلقة إلى أنبوب تجميع مسمى وقم بتحييد التربسين بملليلترين إضافيين من وسط النمو الكامل.

لجمع الخلايا الموجودة في الجزء السفلي من الإدخالات ، قم بغسل قيعان الأغشية مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام ملليلترين من التربسين من البئر المقابل للوحة المكونة من ستة آبار بحيث يتم التقاط الخلايا المنفصلة في قيعان الآبار المناسبة. عندما يتم فصل جميع الخلايا ، قم بتحييد التربسين في كل بئر بستة ملليلتر من وسط النمو الطازج وانقل معلقات الخلية إلى أنابيب التجميع المصنفة. ثم اجمع جميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في 0.7 مل من كاشف التحلل القائم على الفينول والجوانيدين ثيوسيانات لكل أنبوب لاستخراج الحمض النووي الريبي وعزله وفقا للبروتوكولات القياسية.

تؤدي الثقافة القريبة ل HPMC مع خلايا سرطان المبيض إلى زيادة التعبير عن الفيبرونيكتين وعامل النمو المحول أو TGF beta واحد مقارنة بالتحكم في HPMC المزروعة على الإدخالات في حالة عدم وجود خلايا سرطانية. يزداد التعبير عن كل من الفيبرونيكتين و TGF beta واحد أيضا بشكل كبير في خلايا سرطان المبيض عند المزرعة القريبة باستخدام HPMCs مقارنة بخلايا المبيض الضابطة المزروعة في غياب HPMC. على العكس من ذلك ، تظهر خلايا سرطان المبيض المعالجة بوسط HPMC مكيفا انخفاضا كبيرا في تعبير الفيبرونكتين مع عدم وجود تغيير في تعبير TGF beta واحد.

ومع ذلك ، فإن منع TGF beta one بجسم مضاد معادل يؤدي إلى انخفاض كبير في TGF beta التعبير الأول في خلايا سرطان المبيض في الثقافة القريبة مع HPMCs. ومن المثير للاهتمام ، أن زيادة طفيفة في TGF beta one من التعبير في التحكم في خلايا سرطان المبيض غير القريبة من المحتمل أن تكون استجابة تعويضية. تزيد الثقافة القريبة مع خلايا سرطان المبيض بشكل طفيف من تعبير E-cadherin في HPMCs بينما لوحظ انخفاض ملحوظ في E-cadherin في خلايا سرطان المبيض التي تنمو بالقرب من HPMCs مقارنة بالضوابط مما يدل على فعالية نظام الثقافة القريبة لدراسة إشارات paracrine بين خلايا سرطان المبيض والخلايا الطبيعية في موقع ورم خبيث.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تحسين عدد الخلايا البذرة ومدة الثقافة القريبة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل النشاف المناعي للإجابة على أسئلة إضافية حول التغيرات في التعبير عن البروتين وتنشيط مسارات إشارات المعالجة النهائية أثناء الزراعة المشتركة للخلايا الظهارية المتوسطة للخلية السرطانية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيئة الدقيقة للورم ، وعلم المناعة ، وعلم الأحياء التنموي لاستكشاف تفاعلات الباراكرين المتبادلة بين الخلايا من خلال العوامل المفرزة.