التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال كثرة الخلايا مثل دور جزيئات الإشارات في التوسط في امتصاص الخلايا المبرمجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تقديرا كميا واضحا لامتصاص الخلايا المبرمج بما في ذلك امتصاص الخلايا المبرمج الجزئي أو المجزأ والذي لا يظهر دائما مع الطرق الأخرى. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على كثرة الخلايا بواسطة الخلايا المناعية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الظهارية أو الخلايا السرطانية.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب صعوبة تحسين إعدادات الحصول على المجهر. بعد تحضير البلاعم البشرية وخلايا Jurkat موت الخلايا المبرمج ، استخدم مقياس كثافة الدم لحساب الخلايا المبرمجة. ثم انقل كمية كافية من الخلايا المبرمج إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.

حبيبات خلايا Jurkat عن طريق الطرد المركزي عند 500 مرة جم لمدة خمس دقائق. ثم أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS. أثناء وجود خلايا Jurkat في جهاز الطرد المركزي ، قم بنقل 10 ميكرولترات من DMSO في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

بعد ذلك ، قم بإذابة كمية قليلة من NHS-Biotin في DMSO. بعد ذلك ، قم بنقل 500 ميكرولتر من خلية موت الخلايا المبرمج ، وتعليق PBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على DMSO و NHS-Biotin. بعد ذلك ، قم بتخفيف صبغة تتبع الخلايا المناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

احتضان تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام. بعد ذلك ، أضف حجما متساويا من RPMI 1640 مع 10٪ FBS ، واحتضن التعليق في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة خمس دقائق إضافية. بعد ذلك ، قم بتقطيع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بمعدل 500 مرة جم لمدة خمس دقائق.

ثم تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا الملطخة في 100 ميكرولتر من RPMI 1640 مع 10٪ FBS. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا الملطخة إلى كل بئر من الضامة. ثم الطرد المركزي للوحة عند 200 مرة جم لمدة دقيقة واحدة.

احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في حاضنة زراعة الأنسجة. بعد فترة الحضانة المناسبة ، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة. ثم اغسل الخلايا مرتين بمليلتر واحد من PBS.

بعد ذلك ، أضف الستربتافيدين المخفف المترافق ب FITC إلى كل بئر. واحتضان الطبق لمدة 20 دقيقة في الظلام. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من PBS ، ورج العينات برفق لمدة خمس دقائق بعد كل شطف.

ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS لإزالة أي فائض من PFA. قم بتركيب أغطية على شريحة تصوير ، وانقل الشريحة إلى مجهر فلوري.

التقط مداخن Z لعدد كاف من الخلايا للقياس الكمي. من الأهمية بمكان تحديد المسافة بين الأقسام المذكورة بحيث يتم اكتشاف جميع المواد موت الخلايا المبرمج المبتلعة. يجب ألا تكون المسافة القصوى بين الأقسام المذكورة أكبر من العمق البؤري للعدسة الموضوعية ، عادة من 0.5 إلى ميكرومتر واحد.

قم بتحميل أحد مكدسات Z في البرنامج باستخدام ميزة الاستيراد. ثم حدد Integrated density كخيار قياس ضمن لوحة Set Measurements. يكون التحليل أسهل في الإجراء إذا تم عرض كل من قنوات صبغة تتبع الستربتافيدين وتتبع الخلايا كتراكب.

يجب اعتبار أي جسم به تلطيخ الستربتافيدين في أي مكان على طول المحيط إيجابيا للستربتافيدين ، وبالتالي لا ينبغي قياسه كميا على أنه سلبي ستربتافيدين. بمجرد تحميل الصورة ، باستخدام الستربتافيدين وأداة تحديد اليد الحرة أو المضلع ، ضع دائرة حول كل إيجابيات صبغة تتبع الخلايا المواد السالبة ستربتافيدين في مستوى واحد من مكدس Z. بعد ذلك ، قم بقياس الكثافة المتكاملة لصبغة تتبع الخلايا في المنطقة.

في نفس القسم Z ، استخدم تلطيخ الستربتافيدين ، وأداة اختيار Freehand أو Polygon لوضع دائرة حول كل مادة الستربتافيدين الإيجابية لصبغة تتبع الخلية. أخيرا ، قم بقياس الكثافة المتكاملة لهذه المنطقة. باستخدام هذا الإجراء ، مرت أكثر من 95٪ من خلايا جوركات المعالجة بالستاوروسبورين لموت الخلايا المبرمج.

في معظم التجارب ، زاد جزء الخلايا المبرمجة التي يتم إفرارها بطريقة تعتمد على الوقت. عند تحسين هذا البروتوكول لأنواع مختلفة من الخلايا الفعلي ، أو أهداف مختلفة للخلايا المبرمجة ، من المهم اختبار نطاق نسب الخلايا المبرمجة إلى الخلايا الفعلية. عادة ما تعمل نسب 10 إلى واحد أو 30 إلى واحد بشكل أفضل.

يمكن تعديل هذا الإجراء بسهولة لتتبع تنشيط جزيء الإشارات ، أو الاتجار داخل الخلايا عن طريق التعبير عن جينات مراسل الفلورسنت في الخلايا الفعلي ، مما يسمح بتصوير هذه العمليات أثناء كثرة الكريات.