التحديد الكمي لمصنع البروتين للذوبان والهضم الكربوهيدرات المحتوى، استخدام الذرة (ميس زيا) كأنموذج

تسمح هذه الطريقة للباحثين في مجال علوم النبات والبيئة الغذائية بقياس تركيزات البروتينات القابلة للذوبان والكربوهيدرات القابلة للهضم في الأنسجة النباتية بدقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها توفر طريقة سريعة وسهلة لقياس هذين المغذيين الكبيرين المهمين بشكل لا يصدق بدقة عالية. هذه التقنيات لها آثار قوية على مجال البيئة لأن البروتينات النباتية والكربوهيدرات تشكل قاعدة شبكات الغذاء الأرضية.

بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه التقنية لأن هناك العديد من الخطوات وبعض التقنيات التي لا يتم إجراؤها بشكل شائع في مختبر الاستخدام العام. للبدء ، قم بوزن العينات المكررة من كل نسيج في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، سجل الكتلة الدقيقة لكل عينة.

باستخدام ماصة دقيقة ، أضف 500 لتر ميكرو من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار إلى كل أنبوب. أغلق الأغطية بإحكام وقم بتسخين الأنابيب بالصوت لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، ضع الأنابيب في حمام ماء ساخن مسخن مسبقا لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 15 ، 000 جم لمدة 10 دقائق. قم بإخراج المادة الطافية إلى أنابيب جديدة لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة تحمل علامة عليها، باستخدام طرف ماصة جديد لكل عينة. أضف 300 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار إلى الحبيبات ، وكرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وانقله إلى الأنابيب التي تحتوي على المادة الطافية من الطرد المركزي الأول. لتحييد درجة الحموضة للطافي ، أضف 11 ميكرولترا من حمض الهيدروكلوريك المولاري 5.8. استخدم ورق عباد الشمس للتأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو سبعة تقريبا.

بعد ذلك ، أضف 90 ميكرولترا من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك 100٪ إلى كل أنبوب. ثم احتضن الأنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي للعينات عند 13،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

استخدم بعناية خط تفريغ وطرف ماصة زجاجية لإزالة حمض ثلاثي كلورو أسيتيك. احرص على عدم إزعاج الحبيبات بطرف الشفط. بعد ذلك ، اغسل الحبيبات ب 100 ميكرولتر من الأسيتون المبرد إلى 20 درجة مئوية ، ثم اترك الأسيتون يتبخر في غطاء الدخان.

قم بإذابة حبيبات البروتين مع ملليلتر واحد من هيدروكسيد الصوديوم. قد تكون هناك حاجة إلى جولات إضافية من التدفئة والدوامة والتدفئة الصوتية. أضف 160 ميكرولترا من كل محلول قياسي IGG إلى صفيحة مكونة من 96 بئرا بثلاث نسخ ، بدءا من الموضع A1 بعد ذلك ، في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، أضف 50 ميكرولترا من كل محلول عينة إلى 950 ميكرولتر من الماء المقطر.

ثم أضف 60 ميكرولترا من كل عينة مخففة إلى لوحة البئر ثلاث نسخ ، بدءا من موضع H1. أضف 100 ميكرولتر من الماء المقطر إلى جميع آبار العينات الفارغة وغير المعروفة. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 40 ميكرولترا من صبغة بروتين Coomassie Brilliant Blue G-250 إلى كل بئر من اللوحة.

باستخدام إبرة ، قم بتفجير أي فقاعات موجودة في الآبار. بعد ذلك ، اترك اللوحة تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم استخدم مقياس الطيف الضوئي الدقيق لتسجيل قيم الامتصاص لكل بئر عند 595 نانومتر.

أولا ، قم بوزن التكرارات من كل عينة من الأنسجة في أنابيب زجاجية سعة 15 مل. قم بتسمية الأنابيب وتسجيل الكتلة الدقيقة لكل عينة. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من حمض الكبريتيك 0.1 مولار إلى كل أنبوب وأغلق الأغطية بإحكام.

ثم ضع الأنابيب في حمام ماء مغلي لمدة ساعة واحدة. انقل الأنابيب إلى حمام مائي فاتر لتبرد. ثم صب محتويات الأنابيب في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 ملليلتر.

بعد أنابيب الطرد المركزي هذه عند 15 ، 000 جم لمدة 10 دقائق. استخدم ماصة دقيقة لنقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر. باستخدام ماصة ، انقل 15 ميكرولترا من كل عينة غير معروفة إلى أنبوب الاختبار الخاص بها.

ثم أضف 385 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل أنبوب. في غطاء الدخان ، أضف 400 ميكرولتر من 5٪ فينول إلى كل أنبوب اختبار عينة قياسي وغير معروف. بعد ذلك مباشرة أضف ملليلترين من حامض الكبريتيك إلى كل أنبوب.

تأكد من إضافة حمض الكبريتيك إلى سطح المحلول. بعد احتضان الأنابيب لمدة 10 دقائق ، قم بدوامة الأنابيب. ثم احتضان الأنبوب لمدة 30 دقيقة إضافية.

انقل 800 ميكرولتر من كل أنبوب عينة إلى ثلاثة بوليسترين 1.5 ملليلتر شبه ميكروكيفيت. ثم اضبط مقياس الطيف الضوئي على القراءة عند 490 نانومتر ومعايرته باستخدام كوفيت فارغ. أخيرا ، قم بتشغيل كل كوفيت من خلال مقياس الطيف الضوئي وسجل الامتصاص.

باستخدام هذا البروتوكول ، تم تحليل محتوى البروتين القابل للذوبان والكربوهيدرات القابلة للهضم لأربعة أنسجة مختلفة من الحقول والذرة الحلوة من ثلاث مناطق جغرافية. لوحظت اختلافات كبيرة في محتوى البروتين القابل للذوبان بين المناطق ، مما استلزم إجراء تحليلات منفصلة لكل منطقة. عبر المناطق ، كانت هناك العديد من الاختلافات في محتوى البروتين القابل للذوبان والكربوهيدرات القابلة للهضم بين الأنسجة.

في مينيسوتا ، اختلفت الأنسجة فقط في محتوى البروتين القابل للذوبان بينما اختلفت أنسجة ولاية كارولينا الشمالية في كل من البروتين القابل للذوبان والكربوهيدرات القابلة للهضم. يعتمد التباين في محتوى المغذيات الكبيرة للأنسجة في تكساس على التنوع. ستسمح هذه التقنية للباحثين في مجال علوم النبات والبيئة الغذائية بقياس البروتين النباتي القابل للذوبان والكربوهيدرات القابلة للهضم بدقة ، بدلا من الاستقراء من المقاييس الأولية.

لا تنس أن العمل مع النيتروجين السائل والأحماض والقواعد المركزة يمكن أن يكون خطيرا للغاية. لذلك استخدم دائما الاحتياطات مثل القفازات ونظارات السلامة والمآزر والأحذية المغلقة عند العمل مع هذه المواد الكيميائية.