استخراج الكافيين والنشاط الأنزيمي والتعبير الجيني ل Synthase الكافيين من تعليق خلية النبات

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الكيمياء التحليلية والكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية. مثل, ما هي التغييرات التي تحدث في التركيب الحيوي الكافيين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية، هو أنه يمكن تطبيقها على نماذج النباتات إينفيترو التي تنتج الكافيين.

للبدء، إضافة 10 ملليلتر من الأسيتون إلى الخلايا الليسية، وختم القارورة قبل الاختلاط مع خلاط دوامة لمدة 30 ثانية. ثم اخلط العينة عند 100 دورة في الدقيقة مع دوار لمدة خمس ساعات في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إعادة تعليق العينة مع 25 ميكروليتر من الأسيتون.

أولاً، ضعي ميكرولتر واحد من مستخلص الكافيين المعد مسبقًا على ألواح هلام السيليكا. ثم, تطوير TLC في غرفة الكروماتوغرافيا مع 10 ملليلتر من المرحلة المتنقلة, الأسيتون السيكلوهيكسان. تصور عصابات الكافيين في الأشعة فوق البنفسجية قصيرة الطول الموجي، مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية المدمجة.

بعد ذلك، كمي مستويات الكافيين حسب قياس الكثافة في 273 نانومتر. باستخدام ورقة التصفية، فراغ تصفية تعليق الخلية المعدة مسبقا. ثم، استخدام هاون الخزف ل macerate عينة الخلية، مع النيتروجين السائل وRNA كاشف العزل، حتى يتم تجانسه.

بعد ذلك، نقل 500 ميكرولترات من العينة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير معقمة. ثم، إضافة 300 ميكرولترات من الكحول ايساميل الكلوروفورم، و 300 ميكرولترات من الفينول متساوي التوازن. اخلط العينة مع خلاط دوامة و جهاز طرد مركزي في 20، 000G لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.

بعد ذلك، نقل 300 ميكرولترات من المرحلة العليا إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف. ثم، إضافة 200 ميكرولترات من الايزوبروبانول واحتضان الأنبوب لمدة ساعة واحدة في درجة مئوية سلبية 20. إضافة ملليلتر واحد من الإيثانول إلى بيليه.

ثم، الطرد المركزي الأنبوب في 12، 000G لمدة 10 دقائق وdeant المرحلة السائل. بعد ذلك، جفف العينة لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم، إعادة تعليق استخراج الجيش الملكي النيبالي مع 25 ميكرولترات من المياه المعالجة DEPC.

أولاً، أضف اثنين ميكروغرام من إجمالي مستخلص الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير معقمة. ثم، إضافة ميكرولتر واحد من 10X العازلة رد فعل وميكر واحد من DNase. جلب الحجم النهائي للتفاعل إلى 10 ميكرولترات مع المياه المعالجة DEPC.

ثم، مزيج العينة والطرد المركزي في 2، 000G لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد هذا، إضافة ميكرولتر واحد من 50 ميكرومولار الصوديوم ديامينيين رباعية، لوقف التفاعل.

احتضان العينة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، تطبيق 100 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي إلى هلام agarose وتشغيل هلام. تصور سلامة الجيش الملكي النيبالي باستخدام نظام وثائق الصور هلام.

أولاً، أضف 2.5 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى أنبوب أجهزة طرد مركزي صغير. ثم، إضافة ميكرولتر واحد من أوليغو ديوكسيثيميدين التمهيدي وملء الأنبوب إلى حجم النهائي من 13 ميكرولترات مع المياه الخالية من النوى. اخلط العينة والطرد المركزي في 2،000G لمدة دقيقة واحدة.

احتضان العينة في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين. المقبل، إضافة أربعة ميكرولترات من 5X العازلة رد فعل، واثنين من ميكرولترات من مزيج dNTP وميكر واحد من النسخ العكسي للعينة.

ثم، مزيج العينة بلطف والطرد المركزي في 2، 000G لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، احتضان العينة في 45 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة، ثم عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إضافة 7.5 ميكرولترات من 2X طق الحمض النووي البوليمرات و 0.1 ميكرومول من راتيكس، إلى أنبوب الطرد المركزي الجزئي PCR.

ثم، إضافة 0.75 ميكرولتررز كل من التمهيدي إلى الأمام وعكس لتضخيم الجين CCS1. بعد ذلك، إضافة 600 نانوجرام من قالب CDNA. شكل رد فعل التضخيم في الوقت الحقيقي PCR كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم، تحليل البيانات مع برنامج PCR. تزن غرام واحد من المواد الخلوية وحزمة في رقائق الألومنيوم. بعد macerating العينة، ونقلها إلى قارورة الزجاج وإضافة 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت الاستخراج.

بعد ذلك، الطرد المركزي العينة في 20، 000G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل 500 ميكروليترس aliquots في قوارير المبردة. مع مقياس الطيفي، وقياس تركيز البروتين من العينة في 562 نانومتر باستخدام مقايسة حمض bicinchoninic، مع الألبومين البقري كمعيار.

أولاً، إعداد خليط التفاعل في أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة، وفقاً لبروتوكول النص. ثم، زيادة حجم إجمالي إلى 200 ميكرولترات مع 100 ميليمولار تريس HCL. تذكر، لا بد من سلامة الخاصة بك اتباع الاحتياطات المناسبة أثناء إعداد خليط التفاعل مع المواد المشعة.

الحفاظ على أنبوب جهاز الطرد المركزي على الجليد الصغيرة وإضافة حجم من الكسر القابل للذوبان, تحتوي على 7-9 ملليغرام من البروتين. ثم، دوامة الخليط واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد هذا، الطرد المركزي العينات في 11،000G لمدة خمس دقائق.

ثم، استرداد بعناية حجم 900 ميكرولتر، ونقل العينات إلى قارورة التلألؤ. بعد ذلك، يتبخر الكلوروفورم ليكتمل الجفاف في غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة. أضف خمسة ملليلترات من سائل التألق إلى القارورة.

وأخيرا، تحليل النشاط الإشعاعي دمجها في الكافيين باستخدام عداد التلألؤ. في هذا البروتوكول، تم تحليل نمط امتصاص الكافيين عن طريق قياس كثافة TLC، من خلال طيف الضوء المرئي، والقراءة في أقصى امتصاص عند 273 نانومتر. منحنى الفصل من الكافيين على لوحة TLC، وأظهرت الترددات اللاسلكية بين 0.34، و 0.39.

ويظهر الحمض النووي الريبي المستمد من الخلايا المعلقة عمليات فصل واضحة لأفرقة فرعية من 28 و18 و5 وحدات من RRNA، مما يشير إلى أن العينات كانت ذات جودة عالية. وأخيراً، تم الحصول على منحنى ذوبان من تحليل QPCR، الذي يظهر منتج تضخيم واحد لجين الكافيين synthase. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات التكنولوجيا الحيوية والكيمياء الحيوية لاستكشاف ثانوي استقلاب الأنسجة من زراعة القهوة والشاي و coco.

لا تنس أن العمل مع النشاط الإشعاعي وعلم الأمراض الجزيئية يمكن أن تكون خطرة للغاية، وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام القفازات والنظارات الواقية والمعدات الخاصة للمواد المشعة دائما عند إجراء هذا الإجراء.