التحديد الكمي لنشاط نقص التصبغ في المختبر

يصف لنا ثلاثة أساليب تجريبية لتقييم النشاط نقص التصبغ للمواد الكيميائية في المختبر: القياس الكمي لمحتوى النشاط أو 2) الميلانين التيروزينات 1) الخلوية و 3) قياس الميلانين بتحليل صورة وتلطيخ الميلانين الخلوية.

قد تكون هذه الطريقة مفيدة في تطوير مستحضرات التجميل وظيفية وعامل الجلد مع الأنشطة المضادة للميلانوجين. انها هناك لأداء ويمكن الحصول على النتيجة بسرعة. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون هذه الطريقة مفيدة للباحثين، الذين يرغبون في تحديد أو التحقيق في الآثار أو المركبات أو التحقيق في الأنشطة المضادة للميل أو بروميلانوجينيك.

لقياس نشاط التيروزيناس تبدأ بذر B16-F10 مبيدات الميلانين في خمس مرات 10 إلى الخلايا الرابعة في البئر من تركيز 24 لوحة جيدا في المتوسط الكامل لمدة 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية. في اليوم التالي، استبدال المابير في كل بئر مع DMEM تستكمل مع مجمع اختبار أعدت حديثا ومثبط السيطرة أو سيطرة سلبية والعودة لوحة إلى الحاضنة لمدة 72 ساعة أخرى. في نهاية العلاج شطف الآبار مرتين مع 300 ميكرولتر من pbs الباردة في البئر ووضع لوحة على الجليد.

أضف التالي 300 ميكرولترات من العازلة تحلل إلى كل بئر باستخدام مكشطة الخلية لجمع lysates الخلية بعد خمس دقائق. نقل تعليق جزيئات الخلية الناتجة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة الفردية 1.5 ملليلتر. ويجانس الستينات ثلاث مرات لمدة ثانيتين في 14، 500 دورة في الدقيقة على الجليد للافراج عن التيروزيناز بين الخلايا.

بيليه حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي ونقل المواد الفوقية إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفردية 1.5 ملليلتر على الجليد. تخصيص 70 ميكرولترات من كل اغنيض لآبار الفردية من 96 لوحة صغيرة 96 جيدا البوليسترين وإضافة 140 ميكرولترات من حل الركيزة التيروزيناسي لكل بئر من عظمى. يهز لوحة لطيف لخلط محتويات البئر.

ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. وقياس نشاط التيروزيناس في 475 نانومتر على قارئ microplate. لقياس محتوى الميلانين من الخلايا بعد جمع lysate من الخلايا المعالجة كما هو موضح.

جمع lysates عن طريق الطرد المركزي ونقل عظمى إلى أنابيب جديدة. إضافة 300 ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم العادي واحد إلى كل بيليه لمدة ساعة واحدة حضانة في 60 درجة مئوية. متبوعاً بالطرد المركزي لتعليق الخلايا المذابة.

ثم نقل 200 ميكرولترات من superants إلى كل بئر من 96 بئر لوحة. وتقيس محتويات الميلانين على قارئ الصهقرة الدقيقة في طول موجة 400 نانومتر. لفونتانا ماسون تلطيخ، وغسل الخلايا المعالجة مرتين مع 300 ميكرولترات من pbs الباردة وإصلاح الخلايا مع 200 ميكرولترات من 10٪ formalin لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية.

شطف الخلايا السميكة مع الماء المقطر وإضافة 200 ميكرولترات من 58 إلى 68 درجة مئوية فضي الأمونيال حل العمل لكل بئر. لمدة ساعة واحدة حضانة في 37 درجة مئوية أو حتى الخلايا تصبح صفراء اللون في اللون. شطف الخلايا الملطخة بالماء المقطر تليها حضانة لمدة دقيقتين في كلوريد الذهب 0.1٪في درجة حرارة الغرفة.

شطف الخلايا المعالجة من كلوريد الذهب بالماء المقطر وإضافة 200 ميكرولترات من محلول ثيوسلفات الصوديوم إلى الخلايا. بعد دقيقتين شطف الخلايا مرة أخرى. وتسمية الخلايا مع 200 ميكرولترات من الأحمر السريع النووي في بئر لمدة خمس دقائق.

ثم اغسل الخلايا الملطخة بمياه الصنبور قبل التصوير تحت مجهر خفيف. لتحليل العتبة، افتح الصور في الصورة J وحدد الصورة، وضبط، وعتبة اللون. لقياس المنطقة الملطخة مع فونتانا ماسون تعيين شريط المعلمة سطوع إلى الصفر وضبط السطوع إلى النقطة التي يتم فيها تضمين جميع الخلايا الملونة الأسود أو البني.

حدد تحليل وتحليل الجسيمات وحدد مربع التلخيص في إطار تحليل الجسيمات ثم انقر فوق "موافق" للحصول على ملخص النتائج ونسخ ولصق البيانات في جدول بيانات. علاج أربوتين يقمع بشكل كبير النشاط التيروزين الخلوية مقارنة بالخلايا المعالجة مركبة التحكم. وبالمثل فإن محتوى الميلانين من الخلايا حفزت مع Arbutin هو انخفاض كبير بالمقارنة مع الضوابط.

على الرغم من أن الخلايا متشابهة بشكل رفرفولوجي بين مجموعات العلاج، Arbutin يقلل من مساحة الصباغ الأسود مقارنة بالخلايا المعالجة التحكم. هذه الطريقة مفيدة لأنشطة الفحص باستخدام المكتبة المجمعة. هناك أكثر من مئات العينات التي سيتم اختبارها بسرعة.

وعلاوة على ذلك يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة للتحقيق في آلية تنطوي على الميلانوجين. بعد تحديد المركبات المرشحة النشطة بيولوجيا، لشهادتها على دراسة الآليات البيولوجية أو التطبيقات التجارية.