Saccharomyces cerevisiae حركية النمو الهائل في الثقافة دفعة تحليل الأيض معفن والجهاز التنفسي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي مثل ما هي الأساس الجزيئي وراء آثار واربورغ و كرابتري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لدراسة الإنتاجية العالية لآثار بعض المواد في التمثيل الغذائي التنفسي والتخمير. تبدأ من خلال تلقيح أنبوب مخروطي 15 ملليلتر تحتوي على ثلاثة ملليلتر من بارد, عقيمة 2٪ الخميرة استخراج دكستروز بيبتون, أو مرق YPD, مع 250 ميكرولترات من خلايا الخميرة S.cerevisiae المحفوظة في الجلسرين في السلبية 20 درجة مئوية.

احتضان الخميرة بين عشية وضحاها في شاكر المدارية في 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. لs streaking على 60 ملليلتر، 2٪ YPD agar مليئة طبق بيتري في صباح اليوم التالي. ثقافة طبق في 30 درجات مئوية حتى يتم مراقبة المستعمرات المعزولة.

ثم تلقيح مستعمرة واحدة معزولة في أنبوب مخروطي جديد يحتوي على 10 ملليلتر من مرق بارد ومعقم 2٪ YPD للثقافة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز. لإعداد منحنى النمو للصحن الصغير ، إضافة 145 ميكرولترات من وسيلة ثقافية تجريبية مناسبة لكل بئر من 10 في 10 آبار مصغّر مع غطاء وتطعيم كل بئر بخمسة ميكروليترات من ثقافة بين عشية وضحاها. ثم احتضان لوحة متعددة جيدا في قارئ microplate في 30 درجة مئوية مع الانفعالات المستمرة في 200 دورة في الدقيقة لمدة 48 ساعة، وقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر كل 30 أو 60 دقيقة.

لإعداد منحنى النمو المخروطي المخروطي المهتز ، تلقيح 20 ملليلتر قارورة مخروطية تحتوي على 4.8 ملليلتر من وسائط الثقافة العقيمة المناسبة مع 200 ميكرولترات من ثقافة ما قبل التلقيح في كثافة بصرية 600 نانومتر من اثنين للاحتضان عند 30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة. التحريض في 250 الثورات في الدقيقة الواحدة أمر بالغ الأهمية لتحقيق نمو مناسب في تركيزات منخفضة من مصادر الكربون التي تمارس نمو الجهاز التنفسي كما لاحظنا انخفاض نمو الخميرة في ظروف الجهاز التنفسي في أقل سرعة الانفعالات. للسماح بقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر كل ساعتين لمدة 24 ساعة، تمييع 100 ميكرولترات من ثقافة قارورة مخروطية اهتزت في 900 ميكرولترات من الماء المقطر في cuvette مطياف ميليلتر واحد وخلط بلطف من قبل ماصة.

لمعالجة البيانات، في برنامج حزمة إحصائية مناسبة، إنشاء ملف مشروع جديد، افتح جدول جديد وقائمة الرسم البياني، وحدد س ص. ضمن قائمة بيانات العينة، حدد البدء بجدول بيانات فارغ و نقاط و رسم خط ربط. اترك المقطع X غير محدد في الأعمدة الفرعية للنسخ المتماثل أو قيم الخطأ. في المقطع Y، حدد إدخال 10 قيم النسخ المتماثل في الأعمدة الفرعية جنباً إلى جنب ومتوسط المؤامرة والخطأ SD. ثم انقر فوق إنشاء.

أدخل الوقت الذي تم فيه الحصول على قياسات OD في عمود X وقيم OD التي تم الحصول عليها من الثقافات في عمود Y. لتحديد مرحلة النمو الأسي تحويل بيانات عمود Y إلى لوغاريتم، انقر فوق تحليل وحدد تحليل التحويل. استخدام Y يساوي سجل Y لتحديد قيم ص وفتح معرض النتائج.

حدد جدول بيانات التحويل، وانقر فوق تحليل، وحدد تحليل الانحدار الخطي، مع استبعاد قيم الكثافة البصرية التي لا تتبع اتجاه خطي عن طريق تحديد القيم في الجدول والتحكم في الضغط E.In معرض جداول البيانات، وحدد البيانات جدول واحد وانقر فوق التحليل. حدد منحنى الانحدار غير الخطي المناسب للتحليل ومجموعات البيانات لتحليلها، وانقر فوق موافق. ثم تطبيق المربعات الأقل احتواء على البيانات، وترك المقطع الاستيفاء غير محدد، وانقر فوق موافق. بعد ذلك، افتح ملف مشروع جديد، وفي قائمة الجدول الجديد والرسم البياني، حدد خيار العمود، ابدأ بجدول بيانات فارغ، والرسم البياني المطلوب. قم بتعيين الرسم البياني لرسم الوسط مع الانحراف المعياري، وانقر فوق إنشاء.

نسخ قيم وقت الوسط أو دلتا من جدول نتائج احتواء غير الخطية في معرض النتائج ولصق البيانات في عمود. وأخيراً، انقر فوق تحليل وحدد تحليل الاهتمام في قائمة تحليلات العمود لمقارنة المعلمات الحركية للظروف الغذائية المختلفة. تختلف قيم العتبة الحركية للنمو بين نقاط القوة ويجب تقييمها وفقًا للشروط التي نستخدمها في التحليل.

الثقافات التي تظهر نمط ظاهري تخمير لها مرحلة تأخر صغيرة ومرحلة أسية مع معدل نمو مرتفع. الثقافات التي تحصل على الطاقة أساسا عن طريق الفوسفور التأسدي تظهر مرحلة تأخر أطول مع معدل نمو بطيء خلال المرحلة الأسية. حساب معدل النمو المحدد ومضاعفة الوقت من منحنيات النمو باستخدام معادلة النمو الأسي يسمح لتحديد عتبات لقيم النمو في الجهاز التنفسي والتخمير.

على سبيل المثال, في هذه التجارب تمثيلي, آثار تركيزات ريسفيراترول مختلفة على الخلايا S.cerevisiae BY4742 تكشف عن تعديل حالة حيوية الخلية استجابة لتركيزات الجلوكوز متفاوتة. هنا, مكملات مع 10٪ الجلوكوز يوضح أن انخفاض تركيزات الأمونيوم لصالح الأيض التخمير كما يتضح من مرحلة النمو الأسي الموسعة في هذه الثقافات, في حين أن تركيز أعلى يدفع الأيض التخمير الريسبير كما يتضح من مرحلة تأخر طويلة ومعدل نمو أبطأ خلال المرحلة الأسية. وأخيراً، يمكن ملاحظة اختلافات قوية في قيم زمن التخمير المزدوجة بين هاتين السلالات الخميرة المختلفة التي تزرع في ظل نفس الظروف، مما يسلط الضوء على ضرورة التحقق من صحة عتبة الوقت المزدوج لكل سلالة تم تحليلها.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم تذكر أن هذا البروتوكول يستخدم فقط لفرز النمط الظاهري. يجب تأكيد الآثار المحددة على التنفس والتخمير عن طريق مقايسات استهلاك الأكسجين أو عن طريق تراكم المنتجات الثانوية التخمير على التوالي.