الحصول على العَدلات الفخاخ خارج الخلية التي تم إنشاؤها بواسطة العَدلات منخفض الكثافة من الغسل البريتوني السوائل التوسط نمو الخلايا السرطانية والمرفقات

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول دور المجموعات السكانية الفرعية للعدلات في مناعة الورم خاصة حول المشاركة الميكانيكية لمصائد العدلات خارج الخلية ، أو NETs ، في ورم خبيث للورم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتصور التفاعلات اللاصقة للخلايا السرطانية لشبكات الشبكات السليمة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج السرطان.

نظرا لأن NETs المشتقة من مجموعات فرعية محددة من النيوتروفيل قد تعزز ورم خبيث للورم. وسيتم توضيح الإجراء جونكو شونيوهارا من مختبرنا. للحصول على العدلات ، قم أولا بحقن لترا واحدا من محلول ملحي معقم طبيعي مباشرة قبل إغلاق الجرح مباشرة في تجويف البطن للمريض الذي خضع للتو لعملية جراحية في البطن بسبب الأورام الخبيثة في الجهاز الهضمي وغسل تجويف البطن على نطاق واسع لمدة دقيقة واحدة على الأقل.

ثم حرك المحلول الملحي داخل التجويف واسترجع 200 مل من السائل المغسول بأربع محاقن سعة 50 مل. في المختبر ، قم بنقل سائل الغسيل البريتوني من خلال مرشح نايلون 100 ميكرومتر إلى أنابيب فردية سعة 50 مليلتر للطرد المركزي. أعد تعليق الكريات في 5 ملليلتر من PBS مكملة بنسبة 0.02٪ EDTA وتراكب كل معلق خلية بعناية على ثلاثة ملليلتر من محلول تدرج الكثافة.

بعد فصل التدرج الكثافة ، قم بحصاد ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من الطبقة الوسيطة من كل أنبوب واغسل عينات السائل البريتوني في 10 ملليلتر من PBS الطازج بالإضافة إلى EDTA لكل أنبوب. قم بتجميع الكريات في 10 مل من PBS الطازج بالإضافة إلى EDTA لغسل إضافي وقم بتخفيف الخلايا إلى 1 في 10 إلى الخلايا السابعة لكل 60 ميكرولتر من فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية ، أو MACS ، تركيز المخزن المؤقت. قم بحظر أي ربط غير محدد ب 20 ميكرولترا من كتلة Fc لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية متبوعا بإضافة 20 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المضاد ل CD66b.

بعد 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، اغسل الخلايا وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS وأضف الخلايا إلى عمود مغناطيسي بحجم مناسب داخل المجال المغناطيسي لفاصل مغناطيسي مناسب. عندما تمر جميع الخلايا السالبة CD66b عبر العمود ، أضف 15 ملليلترا من المخزن المؤقت MACS الجديد إلى خزان العمود وانقل العمود من الفاصل المغناطيسي إلى أنبوب مخروطي جديد. ثم اغمر العمود على الفور لطرد CD66b الإيجابي المصنف مغناطيسيا في الأنبوب.

بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق العدلات المعزولة منخفضة الكثافة عند خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر من وسط RPMI1640 مكمل بتركيز FBS وبذرة 1 مليلتر من العدلات لكل بئر على ستة بئر مطلي ب poly-L-lysine. بعد ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، تلطخ الخلايا في كل بئر بغشاء فلوري مناسب ، صبغة نووية وكروموسومية غير منفذة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وراقب على الفور مورفولوجيا NETs عن طريق الفحص المجهري الفلوري. لتقييم التصاق الخلايا السرطانية ب NETs ، أعد تعليق خلايا ورم المعدة الملطخة بصبغة الفلورسنت المتناقضة عند واحد في 10 إلى سادس لكل مليلتر من RPMI1640 مكملة بتركيز ألبومين مصل بقري 0.1٪ وإضافة مليلتر واحد من الخلايا السرطانية إلى كل بئر من مزارع العدلات منخفضة الكثافة.

بعد خمس دقائق عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية من كل بئر وغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام 2 مل من RPMI1640 المتوسط المسخن مسبقا مع BSA لكل غسلة. حضانة لمدة خمس دقائق طويلة بما يكفي للكشف عن الارتباط المحدد بالشبكة الشبكية. أضف الوسط الدافئ إلى جانب كل بئر ، وقم بتدوير الطبق برفق ببطء وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام شفاطة.

يمكن بعد ذلك ملاحظة الشبكات والخلايا السرطانية المرفقة عن طريق الفحص المجهري الفلوري. للحصول على تحليل فيديو بفاصل زمني لزراعة الخلايا السرطانية المحاصرة وصمة عار العدلات البريتونية منخفضة الكثافة في طبق 35 ملليمتر ، طبق مطلي ب poly-L-lysine ، كما هو موضح ، متبوعا بغسل قصير في ملليلترين من 0.1٪ BSA بالإضافة إلى RPMI1640. استبدل الوسط بواحد في 10 إلى سادس خلايا ورم معدية غير ملوثة معلقة في ملليلترين من RPMI مكملة ب BSA لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، اشطف الخلايا في ملليلترين من RPMI الطازج المكملة ب BSA لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة متبوعا بدوامة لطيفة لإزالة أي خلايا سرطانية غير متصلة. ثم استبدل المادة الطافية ب DMEM المكملة ب FBS والمضادات الحيوية وقم بتركيب الطبق في نظام مراقبة خلية العرض الكامل لتحليل الفاصل الزمني لمحاصرة الخلايا السرطانية بواسطة NETs. بعد ساعتين من الاستزراع ، تظهر العدلات منخفضة الكثافة الإيجابية CD66b المشتقة من سائل الغسيل البريتوني هياكل خيوطية بواسطة تلطيخ نواوي وكروموسومي فلوري أخضر بينما لا تظهر الخلايا أحادية النواة السالبة CD66b.

عندما تتم معالجة مزارع العدلات منخفضة الكثافة مسبقا ب 100 وحدة لكل مليلتر من الحمض النووي الأول ، يتم تدمير هياكل الخصائص مما يشير إلى أن الهياكل تتكون من الحمض النووي خارج الخلية المطرود من العدلات. عندما يتم زراعة العدلات منخفضة الكثافة على ألواح بلاستيكية غير مطلية ، يمكن ملاحظة العديد من مجموعات NET تطفو داخل الوسط مع وجود عدد قليل من الشبكات المتصلة بقاع الطبق. بعد خمس دقائق من الحضانة باستخدام خط خلية ورم المعدة المسمى بالفلورسنت ، ترتبط العديد من الخلايا السرطانية بالعدلات داخل NETs ، وهي ظاهرة لم يتم ملاحظتها بعد المعالجة المسبقة باستخدام DNAse I.

OKUM-1 و NUGC-4. ومن المثير للاهتمام ، أنه بينما تختفي NETs تدريجيا في غضون عدة ساعات من الزراعة المشتركة للخلايا السرطانية الممتدة ، تبدأ الخلايا السرطانية المحاصرة بواسطة NETs في التكاثر بقوة بعد إطلاق NET. أثناء هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه نظرا لأن NETs تلتصق باللوحة بشكل ضعيف ، يجب إجراء عمليات الغسيل ونقل الأطباق بطريقة حذرة بشكل خاص.

بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مختلف مجالات العلوم الطبية الحيوية لاستكشاف العلاقة السببية بين NETs وأمراض مختلفة مثل تجلط الدم ومتلازمة الاستجابة الالتهابية الجهازية وأمراض المناعة الذاتية.