ميكروبونكتوري الفضاء بومان في الفئران التي يسرتها 2 فوتون مجهرية

يمكن أن تساعد هذه التقنية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول فسيولوجيا النيفرون المفردة، بما في ذلك معدلات الترشيح الكبيبي للبروتينات والاستقلابات النظامية ومساهماتها في علم وظائف الأعضاء الأنبوبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية المجهرية هي أنها تسمح بالوصول إلى مساحة بومان والنيفرون القشرية في جميع الفئران. بشكل عام، الأفراد الجدد لهذا الأسلوب سوف النضال لأنه يتطلب خطوات إعداد تنفيذها بشكل صحيح.

بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القارص، وتطبيق مرهم على العينين واستخدام الشريط لشل الأطراف من 20 إلى 25 غرام الماوس الكبار. استخدام كريم إزالة الشعر لإزالة كل من الشعر على الجانب الأيسر من الحيوان، واستخدام الطحال لتحديد موقع الكلية اليسرى من خلال الجلد على الجانب الظهري والقدوري من الطحال. إجراء شق 0.5 سنتيمتر في الجلد، تليها شق أصغر في الصفاق فقط كبيرة بما يكفي للكلى ليتم دفعها من خلال.

بثق الكلى مع ضغط لطيف ووضع شكل مثبت الكلى polysiloxane حول الأنسجة. خط الكلى حتى مع مفر بحيث سطح أبعد من الكلية يمتد إلى ما وراء المثبت بنحو ملليمتر واحد، وإصلاح الكلى إلى شكل مع مادة لاصقة سيانوكرلات. الغراء لوحة الرأس إلى شكل مثبت وجبل لوحة الرأس إلى تصاعد القضبان على لوحة القاعدة.

المقبل, ملء البئر في دعم polysiloxane مع واحد في المئة حل agarose وعقد زلة غطاء 10 ملليمتر على رأس النموذج حتى agarose هو شركة. ختم زلة الغطاء إلى لوحة الرأس مع الغراء وخلق حلقة حول زلة الغطاء مع الاسمنت الأسنان. ثم حقن 100 إلى 150 ميكرولترات من FITC-Dextran الرجعية المدارية وبسرعة تحريك الماوس ولوحة التثبيت إلى مرحلة المجهر الفوتونتين.

بعد التركيز يدويًا على سطح الكلى، انتقل إلى وضع الفوتون غير المسح الضوئي واستكشف نافذة التصوير لتحديد موقع كبيبات الهدف التي تزيد عن 30 ميكرومترًا أسفل زلة الغطاء وأقل من 400 ميكرومتر من كبسولة الكلى الجانبي. تسجيل المسافة الجانبي والرأسي إلى الكبيبات الهدف. ثم سجل إحداثيات مرحلة x و y و z للقبانيات.

وأخيرا، رفع نقطة محورية الهدف حوالي ملليمتر واحد في عمود الماء دون تغيير إحداثيات مرحلة س و ص. محرك تلميح ماصة في عمود المياه وتشغيل DAPI الإثارة. نقل ماصة في الأبعاد س و ص إلى نقطة الفلورال القصوى من طرف.

وسيكون هذا هو مركز الهدف. تغيير الإعداد الاقتباس x إلى البروتين الفلورسنت الأحمر وتصور ماصة مع العين للسماح بالتمركز الدقيق في طريقة العرض العينية. التبديل مرة أخرى إلى اثنين من الفوتون للعثور على ماصة تحت عرض حية اثنين من فوتون ووضع الطرف بالضبط في وسط الصورة، وهذا هو موقف التسجيل.

ثم حفظ صورة من الماصة وتسجيل المرحلة وإحداثيات وحدة تحكم micropipette. إزالة الماصات من عمود الماء في محور س دون تحريك y و ض محور ونقل الماصات z إلى الهدف glomerulus z-الإحداثي وحافة الكلى. لاحظ المرحلة x وحساب ماص حافة الكلى x باستخدام الإزاحة من مرحلة التسجيل x.

زيادة المرحلة x لتحريك المرحلة نحو ماصة حتى حافة الكلى هو أبعد ما يكون إلى يسار الشاشة، في حين تبقى مرئية. تقدم بسرعة ماصة إلى حوالي 100 ميكرومتر بعيدا عن حصافة الكليه X وقد حسبت للتو. زيادة مكاسب حمراء والبدء في التقدم تلميح ماصة ببطء إلى حافة الكلى تحت حية صور الفوتون مع رصد الرسم البياني بكسل أحمر.

محرك الماصات في محور س ببطء إلى ماصة الهدف glomerulus x، مع إبقاء العين على المرحلة x. عند الوصول إلى كبيبات، وثيقة الموقف مع z-المكدس. مع ماصة في الموقف، تعيين micropump لحقن 100 نانويترات من perfluorodecalin على مدى دقيقتين.

لضمان رقة من الماصة، والحد من الخلط من توصيل ماصة أثناء الدخول. بعد أربع إلى ست دقائق من الترشيح، تعيين micropump لpirate تصل إلى 300 نانولترات بمعدل يصل إلى 50 نانولتر في الدقيقة الواحدة. هذا جميل، وقباني السطح القريب يوضح التصوير مواتية بسبب موقع سطح الكبيات في 20 ميكرومتر تحت كبسولة الكلى.

الكبيات قريبة جدا من السطح للمجهر ومع ذلك، كما سوف تصل إلى زلة الماصة الغطاء. هذه الكبيبات هي في وضع الأمثل مع حواف جانبية 250 ميكرومتر إلى اليمين وتبدو أقل حدة بسبب الانكسار الناجم عن عمق 70 ميكرومتر من الكبسولة. كلا العوامل التي تجعل من الجلجوميري الوصول إليها.

في هذه الصورة النموذجية للدخول الكلوي ، وهو إسقاط متوسط الكثافة من كومة z مع وجهات نظر متعامدة يكشف عن طرف الماصات داخل مساحة بومان ، لاحظ قطعة أثرية طيفية من طرف الماصات الحمراء من الفلوروس مشرق للغاية من النقاط الكم مرتبة على القسم المخروطي من الطرف. هنا ، وتقديم حجم من كومة z المكتسبة بعد وضع ماصة في الفضاء بومان ، ويظهر تلميح ماصة داخل الفضاء المتاخمة لtuft الشعرية. إذا تم استخدام ماصة مع فتحة كبيرة جدا، يمكن كسر كبسولة كلوية تسبب نزيف قبعة فرعية ودخول الدم إلى تجويف الماصات.

وباستخدام هذه الطريقة، تم تحديد 17 بروتينًا، من الوزن الجزيئي المنخفض في المقام الأول، من الببتيدات الفريدة من نوعها في البروتين. إلى جانب هذه الطريقة، يمكن استخدام طرق أخرى مثل التحليل المكي، وقياسات القطب الأيوني الحساس، وحقن الأجسام المضادة الفلورية للإجابة على الأسئلة حول دور السولوتات الإنارةية في علم وظائف الأعضاء الأنبوبي والكبيبية.