والرزن التصاق الديناميكي للتحليل الوظيفي من العلاجات المضادة الالتصاق في مرض التهاب الأمعاء

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيولوجيا المناعية الأساسية وأبحاث أمراض الأمعاء الالتهابية فيما يتعلق بسلسلة الالتصاق من الخلايا المناعية اللازمة لتشخيط الأعضاء الطرفية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة مريحة ومباشرة للإجابة على الأسئلة الوظيفية في سياق التصاق الخلية في ظل ظروف التدفق. على الرغم من أن هذه الطريقة قد وضعت لاستكشاف آلية الخلايا بوتيتيك المضادة للأجسام المضادة في أمراض الأمعاء الالتهابية، فإنه يمكن تعديلها لتحليل قضايا مماثلة في إعدادات الأمراض الالتهابية الأخرى.

تبدأ تمتد قطعة من المطاط أنابيب على جانب واحد مع مقص صغير للسماح لإدراج شعري مستطيلة ما يقرب من 0.5 سم في الأنبوب. ثم ختم الاتصال مع فيلم البارافين. معطف الشعرية مع 20 ميكرولترات من العناوين من الفائدة وختم الجانب غير متصل الأنابيب مع فيلم البارافين البلاستيك لمدة حضانة ساعة واحدة على الأقل في 37 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة، وإزالة فيلم البارافين البلاستيك والسماح للسوائل نقع من الشعيرات الدموية على منشفة ورقية لإفراغ الأنابيب. ثم كتلة الشعيرات الدموية مع 20 ميكرولترات من محلول منع لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 درجة مئوية. من المهم جداً تطبيق الحجب على الشعيرات الدموية مباشرة بعد إزالة الطلاء لتجنب تجفيف الشعيرات الدموية لأن هذا قد يضعف وظيفة البروتينات المشفرة.

في حين يتم حظر الشعيرات الدموية ، إضافة 18 ملليلتر من الدم البشري كله مضاد للتخثر من أنبوب 50 ملليلتر وتمييع الدم إلى حجم إجمالي قدره 35 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني. طبقة 10 ملليلترات من كثافة التدرج المتوسطة تحت محلول الدم وعزل الدم أحادية النوى الطرفية خلايا الدم بالانفروج الانحداري الكثافة. في نهاية الفصل، نقل خلايا أحادية النوى الدم الطرفية من واجهة متوسطة التدرج الكثافة إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر.

و جلب الحجم الكلي في الأنبوب إلى 50 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني جديد. بعد الطرد المركزي، resuspend بيليه في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد للعد وصمة عار الخلايا مع خلية مناسبة تتبع صبغة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. في نهاية التحبيب تلطيخ، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر من تركيز كامل لـ RPMI المتوسطة.

ثم بذور ملليلتر واحد من الخلايا في العديد من الآبار من لوحة 48 جيدا كما أن هناك ظروف. وإضافة الحجم المناسب من الأجسام المضادة للانبات إلى الآبار المناسبة لمدة ساعة واحدة حضانة في 37 درجة مئوية. بعد ذلك استخدام ماصة P1000 لإعادة تعليق الخلايا عدة مرات قبل نقل الخلايا إلى أنابيب ميليلتر الفردية.

شطف كل جيدا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وتجمع يغسل في أنابيب مليلتر المناسب. بعد عد, بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي و resuspened الخلايا في حجم المناسبة من التصاق العازلة للحصول على 1.5 مرات عشرة إلى الخلايا السادسة لكل تعليق ملليلتر. ثم إضافة الحجم المناسب من كلوريد المنغنيز إلى كل أنبوب إلى تركيز نهائي واحد ملليمولار.

عندما تكون الخلايا جاهزة، قم بتشغيل المجهر وحدد الفلاتر المناسبة وأشعة الليزر، ووضع الهدف والحيازة. إزالة فيلم البارافين البلاستيك من غيض من الشعرية واستخدام مقص لتمتد قطعة خمسة سنتيمترات من أنابيب المطاط للسماح شعري أن تكون متصلا أنبوب أصغر. ختم الاتصال بين الشعيرات الدموية وأنبوب مع فيلم البارافين البلاستيك.

وقم بتركيب الشعيرات الدموية على صينية تثبيت. ضع الدرج على حامل الدرج من المجهر حتى يكون الشعر الشعري في التركيز. وأدخل أنابيب المطاط في الشق المقابلة من مضخة الاطّلاع.

ضع الطرف غير المتصل من الأنبوب في أنبوب العينة الأول الذي يحتوي على تعليق الخلية. وأدخل الأنبوب القصير على الجانب الآخر من الشعيرات الدموية في أنبوب 15 ملليلتر لجمع التدفق من خلال. اسمحوا الأنابيب ملء في 500 ميكرولتررس في الدقيقة معدل التدفق حتى تعليق الخلية تصل تقريبا شعري.

ثم اسمحوا شعري ملء بمعدل تدفق 100 ميكرولترات في الدقيقة الواحدة. عندما يتم تعبئة شعري مع الخلايا، وضبط معدل تدفق إلى 10 ميكرولترات في الدقيقة والتقاط الصور الفاصل الزمني للخلايا تتحرك ببطء من خلال شعرية على طول داخل جدار addressin المغلفة كل ثانيتين ما مجموعه ثلاث دقائق. مرة واحدة في تعليق الخلية يصل إلى داخل الشعرية، فمن الأهمية بمكان لتجنب أي انقطاع للتدفق لأن هذا سيؤدي إلى معالجة integrin ثابت التفاعل يحتمل التحيز القياس.

قبل التخلص من تيار الشعرية كلها من خلال العدسة من المجهر للتأكد من أن القسم الملاحظ على الشاشة هو تمثيلي. حرّر الأنابيب من المضخة ودع السائل المتبقي يعود إلى أنبوب المليلتر. ثم قطع الشعيرات الدموية والأنابيب من علبة التثبيت وصورة الشعرية التالية كما أظهرت للتو.

لتقييم تسجيلات الفاصل الزمني، افتح التسلسل الأول في برنامج التحليل المناسب ثم قم بتصدير الصور الثلاثة الأولى والأخيرة كملفات TIFF. افتح الصور الثلاثة الأولى في ImageJ وحدد الصورة، واكتب، و32 بت لتحويل الصور إلى 32 بت. ثم حدد الصورة واللون والقنوات دمج لدمج الصور في صورة واحدة وتحويل الصورة المركبة إلى RGB لحفظ كملف TIFF.

بعد تحويل الصور الثلاث الأخيرة بنفس الطريقة، عد الخلايا البيضاء المرئية في بداية ونهاية الصور المركبة. وطرح عدد من الخلايا البيضاء في الصورة بداية من عدد من الخلايا البيضاء في صورة النهاية. يؤدي تسريب الشعيرات الدموية المغلفة بـ ICAM-1، VCAM-1، MAdCAM-1، ولكن ليس Isotype Fc chimera مع PBMCs البشرية إلى التصاق ملحوظ عند وجود أحد العناوين الثلاثة.

في المقابل، يؤدي تثبيط التفاعلات في عناوين integrin باستخدام الأجسام المضادة تحييد عادة إلى انخفاض ملحوظ من التصاق ديناميكية التي تكون غائبة عند إضافة الأجسام المضادة التحكم isotype. وعلاوة على ذلك، علاج الخلايا التائية بشرية CD4 مع chemokines محددة يؤدي إلى زيادة التصاق للمعالجة مقارنة مع الخلايا البشرية غير المعالجة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم جداً أن نتذكر أن عوامل مختلفة تسهم في التصاق الخلية الحيوية في الجسم الحي التي لا يمكن أن تكون ملخصة تماما في هذا الفحص.

ومع ذلك، فمن الممكن لضبط التشكي لمعالجة أسئلة معقدة جدا. من أجل معالجة أسئلة إضافية على سلوك التصاق التفاضلية من أنواع الخلايا الاختبار، فمن الممكن أيضا لأداء اختبار التصاق تنافسية مع أنواع الخلايا المختلفة التي تحمل علامات تتبع الخلايا المختلفة. بعد تطورها ، مكنتنا هذه التقنية من استكشاف آثار الأجسام المضادة المختلفة المضادة للtegrin المستخدمة أو قيد التطوير حاليًا لعلاج أمراض الأمعاء الالتهابية.