هندسة الأنسجة ظهارة صباغ الشبكية زرع مناسبة المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول العلاج الذاتي للعين ، مثل فعالية الأنسجة المصممة بيولوجيا المصممة خصيصا في الجسم الحي. باستخدام هذه التقنية ، نقدم طريقة لإنتاج أنسجة الشبكية وتحديدها بالإضافة إلى استراتيجية لمعالجة الأنسجة لزرع العين في نموذج حيواني. ابدأ بغسل قطعة إلى أربع قطع 30 × 30 مم من الغشاء الأمنيوسي البشري ، أو hAM.

قم بإصلاح سقالات النايلون مرتين في 80 مل من PBS لكل غسلة في زجاجة سعة 250 مل على شاكر ، بسرعة عالية لمدة خمس دقائق. بعد الغسيل الثاني ، أضف 40 مل من محلول Thermolysin العامل إلى كل زجاجة ، ورج الزجاجات مرتين لمدة خمس دقائق عند 450 دورة في الدقيقة ، متبوعة ب 30 ثانية من الدوامة. بعد الجولة الثانية من علاج Thermolysin ، اغسل القطع مرتين أخريين باستخدام 80 مل من PBS لكل غسلة ، كما هو موضح.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا طويلا معقما لنقل hAMs بشكل فردي ، إلى طبق استزراع 10 سم ، يحتوي على 10 مل من PBS. بعد ذلك ، ضع غشاءا واحدا بحيث يكون النايلون متجها لأسفل في طبق استزراع ثان مقاس 10 سم من PBS ، وافصل اثنين من المشابك الأربعة التي تثبت الغشاء بالنايلون. أدخل الحلقة الأصغر من ملحق الثقافة بين النايلون والغشاء ، مع التأكد من أن الغشاء يغطي الحلقة الأصغر تماما.

قم بقص الجزء الثاني من إدراج المزرعة في الجزء العلوي من الغشاء بحيث يكون الغشاء القاعدي للham مواجها الجانب الأيمن لأعلى في ملحق المزرعة وافصل المقطعين الأخيرين. ثم استخدم مقصا معقما لقص أي غشاء خارج إدراج المزرعة حسب الضرورة. واستخدم الملقط لنقل الغشاء إلى بئر واحد من صفيحة 12 بئرا ، تحتوي على PBS للتخزين عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

قبل البذر ، قوارير التبريد الدافئة التي تحتوي على 1 في 10 إلى خلايا RPE السادسة في 3 مل من وسط RPE في أنبوب مخروطي واحد 15 مل لكل قارورة. عندما تذوب الخلايا ، قم بعمل ماصة للحصول على معلقات خلية واحدة في كل أنبوب من الأنابيب ، واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد ثلاثي المقلاة الأزرق. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات عند سبعة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز مليلتر في وسط RPE الطازج.

بعد ذلك ، قم بشفط PBS من كل بئر من لوحة 12 بئر محضرة ، وأضف 500 لتر صغير من الخلايا إلى وسط كل إدراج ثقافة ، و 1 مل من وسط RPE إلى قاع كل بئر. ثم أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 يوما ، مع تغيير الوسط مرتين في الأسبوع حتى نهاية الثقافة. في يوم الثقافة 30 ، قم بتسخين محلول جيلاتين بنسبة 8٪ في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

واملأ الغرفة الداخلية للاهتزاز بأربع درجات مئوية ثاني أكسيد الكربون2 وسط مستقل. استخدم مشرطا لقطع كتلة 5 سم × 5 سم من كتلة جيلاتين 20٪ مخزنة عند أربع درجات مئوية. قم بتأمين الجانب العلوي من الكتلة على الدعم بمادة لاصقة مناسبة.

ووضع شفرة جديدة في الاهتزاز. اضبط الكتلة حتى تصل إلى نفس مستوى شفرة الحلاقة ، واملأ الحمام حول الدعامة بوسط مستقل جديد بأربع درجات مئوية ثاني أكسيد الكربون. قم بقص الكتلة بسرعة متوسطة حتى يتم قطع الكتلة بشكل موحد بسطح قيادي أملس واضبط الموضع على الصفر.

ثم استنشق الوسط حول الجيلاتين حتى يجف الجيلاتين تماما. واستخدم الملقط لفتح إدراج ثقافة بذرة RPE بعناية أعلى الكتلة. استخدم المقص لإزالة كل الغشاء خارج حلقة الإدخال ، وشفط الحجم الكامل للوسط المتبقي.

أضف ما يصل إلى 1 مل من محلول الجيلاتين السائل بنسبة 8٪ إلى الغشاء حتى يتم تغطيته. وقم بإزالة أي جيلاتين زائد بعناية. بعد خمس إلى ثماني دقائق ، أضف أربع درجات مئوية ثاني أكسيد الكربون الطازج إلى الحمام حتى يتم تغطية الغشاء المتصلب.

ومع الاهتزاز في وضع 100 ميكرون ، قم بقطع جزء من الغشاء بسرعة متوسطة ، مع الحرص على الحفاظ على اتجاه الأنسجة. قطع زاوية من القسم بمشرط للسماح بتحديد اتجاه القسم. واستخدم ملعقة لنقل الغشاء المدمج في الجيلاتين إلى واحدة من ستة ألواح آبار مملوءة بوسط حفظ أربع درجات مئوية.

يمكن عكس اتجاه الشريحة بسبب الحركة المحررة قبل قطع الزاوية. لذا احرص على تأمين موضع الشريحة بعد القسم مباشرة. يمكن بعد ذلك تعديل حجم الغرسة وفقا لحجم العين المتلقية تحت المجهر الجراحي ، قبل الزرع.

عادة ما تبقى بعض الخلايا الميتة على سطح الغشاء ، بعد التثبيت على إدراج المزرعة ، ولكن يتم التخلص من هذه الخلايا عند تغيير وسط الاستزراع. تظهر ألياف الغشاء القاعدي بتكبير أعلى عندما لا تبقى خلايا ، مما يشير إلى أن فترة العلاج بالثيرموليسين قد تم تحسينها. تصبح ظهارة الشبكية أسهل في الرؤية تحت المجهر ، حيث تنضج ، وتشكل طبقة أحادية كاملة تشبه الحصى في ثلاثة أسابيع.

في أربعة أسابيع ، تكون الظهارة ناضجة بما يكفي لتكون جاهزة للزرع. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن حالة الجيلاتين تعتمد على درجة الحرارة. لذا احرص على اتباع درجات الحرارة الموصى بها بدقة.

بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج بالخلايا الجذعية ، لاستكشاف الإمكانات العلاجية للأنسجة المعدلة بيولوجيا في نموذج حيواني لالتهاب الشبكية الصباغي. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتحضير نسيج فوق سقالة ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها على أنظمة أكثر تعقيدا تحتوي على طبقات مستقبلات ضوء. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب صعوبة التعامل مع الأغشية السلوية البشرية ، وهي رقيقة جدا وتميل إلى الانفتاء بسهولة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم تثبيت الغشاء الأمنيوسي البشري وخطوات تضمين الجيلاتين ويتطلب نهجا معينا للتعامل معه.