تقييم شامل لفعالية وسلامة إيصال الأدوية المستهدفة للمشيمة باستخدام ثلاثة أساليب تكميلية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب النانوي حول فعالية وسلامة الدواء المحمل على الجسيمات النانوية التي يتم تسليمها إلى الأم والجنين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل القياس الكيميائي الحيوي الدقيق لكمية الدواء التي يتم توصيلها إلى المشيمة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج مضاعفات الحمل بوساطة المشيمة لأنه من المهم ضمان الاستهداف الدقيق لتوصيل الدواء إلى المشيمة.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يتطلب التقييم بالموجات فوق الصوتية عالي التردد للتطور الجنيني الصبر والخبرة لإتقانها. لحقن الجسيمات النانوية في الوريد ، انقل فأر حامل في اليوم الجنيني 14.5 مع أوردة الذيل الموسعة بالحرارة إلى مصفاة ، ونظف الذيل بمسحة كحولية. ثم أدخل طرف الإبرة لحقنة الأنسولين عيار 28 في وريد الذيل الموسع ، واضغط ببطء على المكبس على مدى خمس إلى 10 ثوان بضغط متساو لتوصيل الجسيمات النانوية إلى وريد الذيل.

بعد 30 دقيقة من الحقن، ضع الفأر الحامل المخدرة في غرفة التصوير لنظام التصوير الفلوري في الجسم الحي في وضع ضعيف. حدد التألق ثنائي الأبعاد والمعلمات الفوتوغرافية المناسبة لتصوير إشارات التألق الأخضر الإندوسيانين ، واضبط التعرض على الأطوال الموجية للإثارة والإثارة والانبعاث على 710 و 820 نانومتر ، على التوالي. ثم تخيل ، وأعد الفأر الحامل إلى قفصه.

بعد 48 ساعة من الحقن ، استخدم ملقط Graefe ، وملقط أنسجة Graefe ، ومقص تشريح لجمع الأجنة والمشيمة ، وتصوير الأنسجة المحصودة كما هو موضح للتو للحيوان بأكمله. لتقييم الموجات فوق الصوتية عالية التردد للتطور الجنيني ، بعد 24 ساعة من حقن الجسيمات النانوية ، قم بتأمين سد الحامل المخدر على منصة تصوير بالموجات فوق الصوتية المسخنة مسبقا من 37 إلى 42 درجة مئوية في وضع الاستلقاء ، ووضع محول الطاقة 40 ميجاهرتز في الذراع الميكانيكي. ثم اضبط موضع محول الطاقة للحصول على صور طولية للجنين والمشيمة مع منطقة الاهتمام داخل المنطقة البؤرية.

للتصوير والتحليل في الوضع B ، حدد الوضع B وقم بخفض محول الطاقة فوق البطن حتى يظهر الجنين والمشيمة. انقر فوق Scan/Freeze لبدء التصوير وإيقافه، وCine Store لتخزين الحلقة السينمائية، وFrame Store لتخزين صور الإطار. ثم انقر فوق قياس لتحليل طول كيس الحمل ، وطول ردف تاج الجنين ، وقطر الجدارية ، ومحيط البطن ، وقطر المشيمة ، وسمك المشيمة.

لتصوير وتحليل دوبلر بالموجات النبضية، باستخدام نفس إسقاط المسح، انقر أولا فوق اللون، ثم حدد الموجة النبضية، ثم ضع مربع حجم أخذ العينات في وسط الشريان السري. انقر فوق مسح ضوئي/تجميد لبدء التصوير ومخزن سينما لجمع صور الشريان السري. ثم انقر فوق قياس لحساب سرعة الذروة للشريان السري.

للتصوير والتحليل في وضع دوبلر الملون، باستخدام نفس إسقاط المسح الضوئي، انقر فوق اللون، واضبط موضع محول الطاقة للحصول على صور لقلب الجنين كما هو موضح. ثم انقر فوق قياس لحساب معدل ضربات قلب الجنين لحلقة الصورة السينمائية المخزنة. بالنسبة لتحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط ، أو HPLC ، قم أولا بحقن فأر حامل في اليوم الجنيني 14.5 بجرعة واحدة من الجسيمات النانوية كما هو موضح.

بعد 24 ساعة ، قم بتنقية قلب الحامل ب 50 مل من محلول ملحي مثلج 0.9٪ لمدة 10 دقائق لإزالة أي جزيئات نانوية غير مرتبطة ، وجمع الأجنة والمشيمة لتخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر. في يوم التحليل ، أضف 500 ميكرولتر من محلول التجانس المحضر حديثا إلى كل عينة من الأنسجة 200 ملليغرام ، وقم بتجانس العينات مرتين بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية لكل تفكك. بعد التجانس الثاني ، قم بالطرد المركزي للعينات وتصفية المواد الطافية من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر في قارورة HPLC.

ضع قوارير العينة في صينية أخذ العينات الأوتوماتيكية للحقن ، وقم بتشغيل مزيل الغاز HPLC لإزالة الهواء من النظام. بعد ذلك ، قم بتشغيل التدفق لموازنة العمود مع المرحلة المتنقلة لمدة 30 دقيقة لتقليل ضوضاء خط الأساس ، واضبط درجة حرارة العمود على 25 درجة مئوية. ثم قم بحقن أحجام عينة سعة 20 ميكرولترا بمعدل تدفق واحد مليلتر في الدقيقة في غضون 30 دقيقة ، وانقر فوق طريقة التشغيل لبدء التحليل.

عند اكتمال عمليات التشغيل ، قم بتغيير المرحلة المتنقلة يدويا إلى أسيتونيتريل من الدرجة HPLC ، وقم بتشغيل الأسيتونيتريل لمدة 15 دقيقة تقريبا لحماية النظام. يكشف التصوير في الجسم الحي عن إشارات خضراء قوية للإندوسيانين في أنسجة الرحم بعد 30 دقيقة من حقن الجسيمات النانوية المترافقة بالكبريتات المشيمية ، بينما تتمركز الجسيمات النانوية غير المرتبطة بشكل أساسي بالكبد والطحال. بعد 48 ساعة من الحقن ، لوحظت إشارة الفلورسنت في مشيمة المحقونة بالجسيمات النانوية المرتبطة بكبريتات شوندروتن المشيمة ، مع عدم اكتشاف أي إشارات داخل الجنين.

تكشف المراقبة بالموجات فوق الصوتية عالية التردد للحيوانات المحقونة بالجسيمات النانوية المترافقة مع كبريتات شوندروتن المشيمة عن انخفاض كبير في المعالم الرئيسية لنمو الجنين والمشيمة. ومن المثير للاهتمام أن العلاج بالجسيمات النانوية المرتبطة بالميتوتريكسات يضعف أيضا بشكل طفيف نمو الجنين والمشيمة ، مما يشير إلى أن الجسيمات النانوية قد تحسن توصيل الميثوتريكسات إلى المشيمة من خلال تعزيز النفاذية وتأثير الاحتفاظ. يشير قياس تركيزات الميثوتريكسات بواسطة HPLC إلى وقت احتفاظ مدته سبع دقائق داخل المشيمة للفئران المحقونة بالجسيمات النانوية المرتبطة بالميثوتريكسات.

بعد 24 ساعة من الحقن، تكون مستويات الميثوتريكسات المشيمية في المجموعة المحقونة بالجسيمات النانوية المرتبطة بالميثوتريكسات أقل بكثير من تلك المقاسة في مجموعة كبريتات شوندروتن المشيمة والجسيمات النانوية المرتبطة بالميثوتريكسات، مع عدم اكتشاف أي ميثوتريكسات في أجنة الأخير. لا يزال من الممكن اكتشاف الميثوتريكسات في المشيمة بعد 48 ساعة من حقن كبريتات شوندروتن المشيمة وحقن الجسيمات النانوية المرتبطة بالميثوتريكسات ، مما يدل على أن كبريتات شوندروتن المشيمة والجسيمات النانوية المرتبطة بالميثوتريكسات لا يمكن أن تعبر المشيمة ، وبالتالي تقليل الآثار الضارة المحتملة على الجنين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن المشيمة تبدأ في التكون في حوالي اليوم الجنيني 9 1/2 ، وبالتالي يتم إجراء تجربة التصوير في الجسم الحي بشكل أفضل في اليوم الجنيني 10 1/2 أو بعد ذلك.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تلطيخ الفلورسنت المناعي والتحليل للإجابة على أسئلة إضافية حول توطين الجسيمات النانوية داخل المشيمة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الطب التناسلي لاستكشاف إمكانية العلاج الموجه للمشيمة في مضاعفات الحمل.