إجراء جنبا إلى جنب على أساس اليغنوكليوتيد عزل الحمض النووي الريبي لاسترداد مجمعات البروتين مرناً حقيقية النواة

ويرد وصف إجراء عزل الحمض النووي الريبي جنبا إلى جنب (رحلة) لانتعاش مجمعات البروتين مرناً اندوجينوسلي المشكلة. على وجه التحديد، مجمعات البروتين الحمض النووي الريبي كروسلينكيد في فيفو، الكشف بوليادينيلاتيد المعزولة من مقتطفات مع الخرز oligo(dT)، ويتم التقاطها مرناس خاصة مع تعديل الجيش الملكي النيبالي النوكليوتيد العقاقير. يتم الكشف عن البروتينات منضمة إلى مرناس بتحليل إيمونوبلوت.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تنظيم التعبير الجيني مثل كيفية تجمع البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي على RNAs معينة في الجسم الحي وبالتالي فرض تنظيم الجينات بعد النسخ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تحتاج إلى أي استنساخ أو معالجة جينية. يمكن تكييفه مع أي كائن حي نموذجي أو نوع فرعي.

لتصميم قليل النوكليوتيدات ، قم بتحليل الهيكل الثانوي ل mRNA أو جزء منه باستخدام أدوات عبر الإنترنت. أولا ، أدخل تسلسل النيوكليوتيدات في المربع الفارغ ، ثم في مربع الخيارات الأساسية حدد الحد الأدنى من الطاقة الحرة وتجنب أزواج القواعد المعزولة. في مربع خيارات الإخراج ، حدد مخطط البنية الثانوية للحمض النووي الريبي التفاعلي ، وأخيرا انقر فوق الزر "متابعة".

ستظهر نافذة جديدة تعرض الهيكل الثانوي لل mRNA محل الاهتمام. حدد ما لا يقل عن ثلاثة تسلسلات مختلفة من 21 إلى 24 نيوكليوتيدات داخل mRNA محل الاهتمام ، ويفضل في المناطق التي تفتقر إلى الهياكل الثانوية الواسعة وتقع في مناطق غير مترجمة من 3 أوب. حدد المناطق ذات نسبة الجوانيدين / السيتوزين القريبة من 50٪ وتفتقر إلى تكرار ترادف النيوكليوتيدات لتجنب التكوين المحتمل لدبابيس الشعر أو التلدين الذاتي.

صمم يدويا قليل النوكليوتيدات الحمض النووي الريبي المعدلة 2-prime-methoxy التي تحمل جزءا من البيوتين في 3-prime والتي تكمل تماما المناطق المحددة داخل mRNA المستهدف المطلوب. استخدم أداة مناسبة عبر الإنترنت لضبط درجة حرارة انصهار هجينة الحمض النووي الريبي إلى ما بين 60 و 65 درجة ووجود تعقيد تسلسل لغوي جيد. استخدم أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية للبحث عن التهجين المتبادل المحتمل ل ASO مع mRNAs الأخرى في النسخ.

حدد Nucleotide BLAST ، وأدخل التسلسل في المربع الفارغ ، وحدد الكائن الحي محل الاهتمام. احتفظ بالمعلمات المتبقية كإعداد افتراضي وانقر فوق BLAST. قم بعمل خلايا HEK293 عبر التقاء 70٪ في طبق زراعة أنسجة يبلغ طوله 10 سم عن طريق خلط ميكروغرامين من جين المراسل مع 20 ميكرولترا من كاشف التعدي وإضافته إلى الخلايا.

ضع الخلايا في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل الحصاد. في يوم الحصاد ، قم بإزالة الوسط بماصة مصلية واغسل الخلايا بسرعة مرتين باستخدام 10 مل من PBS الدافئ مسبقا عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف ستة ملليلتر من PBS إلى الطبق وضعه على الثلج.

ثم تعرض الخلايا للأشعة فوق البنفسجية بسرعة 100 مللي جول لكل سنتيمتر مربع في الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، اكشط الخلايا و PBS وانقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. ثم قم بتدوير الخلايا عند 250 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد إزالة المادة الطافية باستخدام ماصة ، أعد تعليق الخلايا في ملليلترين من محلول التحلل المبرد مسبقا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل خمس أو ست مرات مع إبقاء الأنبوب على الجليد. انقل المحللة باستخدام ماصة إلى أنبوب سعة خمسة ملليلتر يوضع على الجليد والصوتنة لمدة ثلاث جولات تتكون من رشقات نارية مدتها 20 ثانية بسعة 10 ميكرون مع 30 ثانية من فترات التبريد على الجليد. بعد نقل المحللة إلى أنابيب ملليلتر ، جهاز طرد مركزي عند 15 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

اجمع المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب جديد. لبدء عزل الحمض النووي الريبي ، قم بموازنة ملليغرام واحد من الخرز المغناطيسي المقترن بقليل قليل (dT) في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل. قم بإزالة الأنبوب من الدوار ، وضعه على رف مغناطيسي ، وقم بإزالة عازلة التحلل.

امزج أربعة ملليغرامات من مستخلص بروتين HEK293 مع الخرز المغناطيسي المقترن ب oligo (dT) 25. اخلطي العينات بقوة ، ثم احتضنها لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي لمدة 10 ثوان ، ثم قم بإزالة المادة الطافية.

احتفظ بالمادة الطافية على الجليد لجولات التعافي اللاحقة. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل A إلى الخرز والدوامة لمدة خمس ثوان. اجمع الخرزات بمغناطيس ثم اغسل الخرزات مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل B.To تخلص من الحمض النووي الريبي ، وأضف 30 ميكرولترا من 10 ملليمولار Tris-HCl واحتضان الأنبوب عند 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين مع اهتزاز مستمر عند 1,000 دورة في الدقيقة.

انقل الأنبوب مباشرة إلى الحامل المغناطيسي واجمع المصف في أسرع وقت ممكن بعد 10 ثوان أو نحو ذلك لمنع إعادة الارتباط المحتمل للرنا المرسال بالخرز في درجات حرارة منخفضة. ثم يتم دمج المواد المشطة من الجولات المتكررة ويمكن تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لالتقاط mRNAs محددة ، أضف 30 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المقترن بالستربتافيدين إلى مليلتر واحد من مخزن الربط والغسيل الذي يحتوي على 0.1 ملليغرام لكل مليلتر من الحمض النووي الريبي لنقل الإشريكية القولونية.

توازن على دوار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة ، اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 750 ميكرولتر من الربط والغسيل العازلة. قم بتدوير الأنبوب ، ثم قم بإزالة المخزن المؤقت بالأبيض والأسود ، ثم أعد تعليقه في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت واحتفظ به على الثلج حتى الاستخدام.

قم بتخفيف ما يقرب من 35 ميكروغراما من البروتين الكلي من عزل بولي (أ) سابقا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط والغسيل ، ثم أضف 200 بيكومول من قليل النوكليوتيد المضاد للمعنى المناسب واحتضانه عند 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتسهيل التلدين. قم بإزالة كتلة الحرارة بالكامل من الجهاز وضعها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لتبرد ببطء. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المتوازن المقترن بالستربتافيدين إلى العينة ، ثم احتضن الخليط لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر عند 950 دورة في الدقيقة في الخلاط.

ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي ، وقم بإزالة المادة الطافية ، واغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 750 ميكرولتر من الغلاف الدافئ مسبقا وغسل المخزن المؤقت عند 55 درجة مئوية. أضف 20 ميكرولترا من 10 ملليمولار Tris-HCl وضعها على 90 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 950 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق لتصفية الحمض النووي الريبي. بعد 10 دقائق ، ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي واجمع التصفية على الفور.

هذا هو هلام الاغاروز المستخدم للكشف عن mRNAs باستخدام RT-PCR باستخدام بادئات محددة عند التقاطها باستخدام oligo (dT) وقليل النوكليوتيد المضاد للمعنى إلى p27 mRNAs من مستخلص خلية HEK293. يتم أيضا عرض عنصر تحكم بدون قليل النوكليوتيدات المضادة للحساس. تظهر ممرات الإدخال إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا المترابطة.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا عرض نتائج المنافسة مع poly (A). يظهر هنا تحليل اللطخة المناعية للبروتينات المرتبطة ب mRNA مع الأجسام المضادة التي تكتشف المستضد البشري R ، والبروتين غير المعروف المرتبط بالحمض النووي الريبي ، وبيتا أكتين ، وهو بروتين تحكم سلبي. تظهر اللطخة أنه تم اكتشاف المستضد البشري R بنجاح في عزلات poly (A) RNA عند التقاط p27 mRNAs مع قليل النوكليوتيدات المضادة للحساس.

لم يتم اكتشاف المستضد البشري R في عزلات التحكم بدون قليل النوكليوتيد المضاد للحساس. تظهر ممرات الإدخال البروتينات الموجودة في المستخلص من الخلايا المتشابكة وتظهر أيضا نتائج المنافسة مع بولي (أ). باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طريقة أخرى مثل قياس الطيف الكتلي لتحليل العينة الكاملة من البروتين التي تتفاعل مع RNA معين في الجسم الحي.

الأهم من ذلك ، أن TRIP هو نهج متعدد الاستخدامات يمكن تكييفه مع جميع أنواع الحمض النووي الريبي متعدد الأدينيل عبر الكائنات الحية لفهم الترتيب الديناميكي لتفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي. لذلك ، يمكن استخدامه للتحقيق في الحمض النووي الريبي الذي يتم التحكم فيه عن النمو أو المرتبط بالأمراض وقد يؤدي في النهاية إلى أهداف جديدة للتدخل العلاجي.