ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في دراسة اتجاهات البروتينات مع أغشية الدهون. في حالتنا، استخدامه لتحليل ربط الكالسيوم الاعتمادية من الملحقات إلى فوسفوليبيدات مشحونة سلبا. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها حرة التسمية، حساسة، كمية، وأنه يمكن ملاحظة التفاعلات في الوقت الحقيقي.

وبالتالي يسمح التحليل المباشر للنتائج الحقيقية. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية على أنظمة أخرى، مثل التفاعل بين الجمعيات micromolecule أكثر تعقيدا أو حتى الخلايا. استخدام حلول الدهون 5 مليمولار واضحة كما هو موضح في بروتوكول النص.

الجمع بين الدهون الذائبة في نسبة المولى المطلوب في أنابيب الزجاج 10 ملليلتر. يتبخر المذيبات العضوية باستخدام تيار جاف من النيتروجين. ترك خليط الدهون على نظام التجميل فراغي عالية لمدة ثلاث ساعات لإزالة أي آثار المتبقية من المذيبات.

الآن، resuspend فيلم الدهون في ملليلتر واحد من العازلة سيترات. احتضان تعليق الدهون في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي، دوامة ذلك بقوة كل خمس دقائق. درجة الحرارة هذه حوالي 10 درجة مئوية فوق درجة حرارة المرحلة الانتقالية من أعلى ذوبان الدهون في الخليط.

وفي الوقت نفسه، سخني الطارد المجهز بغشاء بولي كربونات بحجم 50 نانومتر فوق درجة حرارة الانتقال لمدة 30 دقيقة. قم بتحميل تعليق الحى متعدد البرمل في الطارد المُحمّى مسبقًا. تمرير بلطف الخليط 31 مرة من خلال غشاء البولي لتشكيل هواسيكلات unilamellar صغيرة أو سيارات الدفع الرباعي.

الحفاظ على درجة الحرارة فوق درجة حرارة الانتقال. نقل تعليق سيارات الدفع الرباعي إلى وعاء تفاعل بلاستيكي ملليلتر اثنين وإضافة العازلة سترات لجعل الحجم النهائي إلى مليلتر اثنين. احتضان أربعة أجهزة استشعار إدراجها في حامل متعددtetrafluoro الإيثيلين في حل 2٪ SDS لمدة 30 دقيقة على الأقل.

ثم يغسل لهم على نطاق واسع مع المياه النقية جدا لإزالة تماما SDS ومحاولة لهم باستخدام تيار من الأرجون الجاف أو النيتروجين. استخدام نظام تنظيف البلازما لإزالة تماما أي الملوثات. للقيام بذلك، أدخل أجهزة الاستشعار الجافة في غرفة تنظيف البلازما، وإخلاء الغرفة، ومسحها ثلاث مرات مع الأكسجين.

ثم، تشغيل منظف البلازما. استخدام فراغ، وارتفاع طاقة الترددات الراديوية، و 10 دقيقة من وقت العملية. بعد تشغيل التنظيف، إيقاف تشغيل الجهاز والخروج أجهزة الاستشعار.

قم بإرساء أجهزة الاستشعار التي تم تنظيفها بالبلازما بعناية في غرف التدفق الأربعة باستخدام الملاقط. تجنب أي ضغط على أو التواء من الغرف والأنابيب التي قد تسبب تسرب. قم بمسح النظام بمخزن citrate المؤقت في وضع التدفق المفتوح لمدة 10 دقائق.

إطلاق البرنامج. ابدأ في تسجيل أي تغييرات في التردد وتبديد النغمة الأساسية الأولى والإيغام باستخدام البرنامج حتى تصبح خطوط الأساس للتردد وتبديدها ثابتة. عندما تكون خطوط الأساس مستقرة، تطبيق تعليق SUV في العازلة سترات.

باستخدام وعاء رد فعل، إزالة 1.5 ملليلتر من حجم الميت، ثم إغلاق النظام في وضع تدفق الحلقة. سجل تحول تبدد التردد لمدة 10 دقائق أخرى. عندما يكون SLB مستقرًا، اُجري توازنًا في النظام مع مخزن مؤقت في تركيزات الكالسيوم المطلوبة في وضع التدفق المفتوح لمدة 40 دقيقة.

إضافة البروتين إلى المخزن المؤقت الذي يحتوي على الكالسيوم. تنفيذ تطبيق البروتين في وضع تدفق حلقة حتى يتم التوصل إلى حالة ثابتة التوازن. الآن، افصل البروتين المقيد عن طريق chelating أيونات الكالسيوم مع خمسة ملليمولار EGTA في المخزن المؤقت قيد التشغيل في وضع التدفق المفتوح.

تجديد نظام الثقل الدقيق مع 50 ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة في وضع التدفق المفتوح المستمر. إزالة الأنابيب من حاوية المياه والسماح للنظام تشغيل الجافة. قم بإزالة مستشعر الكريستال بعناية وانظفه باستخدام محلول SDS بنسبة 2٪ باستخدام حامل البوليtetetrafluoroethylene.

جفف الأجزاء المرئية من وحدة التدفق الداخلية حيث تم وضع المستشعر. يظهر هنا، هو تسجيل منحنى التردد وتبديدات التبدد. الانخفاض البارز في التردد عند إضافة الليبوزومات ، يشير إلى امتصاصها لأن الحويصلات المملوءة العازلة ليست جامدة ولكنها فيزيائية ، يزيد التبدد.

في وقت لاحق، تمزق الفينات. الافراج عن ما يصاحب ذلك من العازلة داخل الحويصلات يقلل من كتلة مُمتزة حتى يتم التوصل إلى هضبة مستقرة. إن ربط Annexin A2 بالدهون يضيف كتلة كما يراها تحول التردد الواضح، ولكنه لا يتعارض مع بنية الطبقات الثنائية كما هو مبين في التغير الصغير الوحيد في التبدد.

عندما تتم إزالة أيون الكالسيوم من قبل وكيل chelating، EGTA، الملحق A2 ينفصل عن فيلم الدهون. التردد وتبديد التسجيلات التحول إلى المستويات التي ينظر إليها مع bilayer تشير فقط إلى الملحق A2 ملزمة كليا تعتمد على أيون الكالسيوم وأن الفيلم الدهون لا تزال سليمة. تظهر هنا تجربة تحكم سالب تمثيلية.

عندما phosphatidylserine غير موجود، لا توجد تغييرات في التردد أو تبديد واضحة بعد إضافة الملحق A2 في وجود أيون الكالسيوم. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم ضمان تشكيل ثنائي الطبقات السليم. استخدام الليبوسومات على الفور، وإلا فإن الحويصلات الصغيرة تصهر في أكبر منها مع التوتر السطحي أقل التي يمكن أن تؤدي إلى خط أساس غير مستقر.

بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء وصف كمي لتفاعل البروتين الغشاء من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التعاونية مقابل غير التعاوني ملزمة.