ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو
نوفمبر 1, 2018
نقدم هنا، بروتوكولا تجريبية التي يمكن أن تستخدم لتحديد الانتماءات الملزمة وطريقة التفاعل البروتين ملزمة فسفوليبيد خالية من تسمية annexin A2 مع المعطل تداولها المدعومة من الصلبة بيلاييرس (SLB) عن طريق قياس في وقت واحد الإقبال الجماهيري وخصائص لزج مطاطي من البروتين أنيكسين A2.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في دراسة اتجاهات البروتينات مع أغشية الدهون. في حالتنا، استخدامه لتحليل ربط الكالسيوم الاعتمادية من الملحقات إلى فوسفوليبيدات مشحونة سلبا. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها حرة التسمية، حساسة، كمية، وأنه يمكن ملاحظة التفاعلات في الوقت الحقيقي.
وبالتالي يسمح التحليل المباشر للنتائج الحقيقية. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية على أنظمة أخرى، مثل التفاعل بين الجمعيات micromolecule أكثر تعقيدا أو حتى الخلايا. استخدام حلول الدهون 5 مليمولار واضحة كما هو موضح في بروتوكول النص.
الجمع بين الدهون الذائبة في نسبة المولى المطلوب في أنابيب الزجاج 10 ملليلتر. يتبخر المذيبات العضوية باستخدام تيار جاف من النيتروجين. ترك خليط الدهون على نظام التجميل فراغي عالية لمدة ثلاث ساعات لإزالة أي آثار المتبقية من المذيبات.
الآن، resuspend فيلم الدهون في ملليلتر واحد من العازلة سيترات. احتضان تعليق الدهون في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي، دوامة ذلك بقوة كل خمس دقائق. درجة الحرارة هذه حوالي 10 درجة مئوية فوق درجة حرارة المرحلة الانتقالية من أعلى ذوبان الدهون في الخليط.
وفي الوقت نفسه، سخني الطارد المجهز بغشاء بولي كربونات بحجم 50 نانومتر فوق درجة حرارة الانتقال لمدة 30 دقيقة. قم بتحميل تعليق الحى متعدد البرمل في الطارد المُحمّى مسبقًا. تمرير بلطف الخليط 31 مرة من خلال غشاء البولي لتشكيل هواسيكلات unilamellar صغيرة أو سيارات الدفع الرباعي.
الحفاظ على درجة الحرارة فوق درجة حرارة الانتقال. نقل تعليق سيارات الدفع الرباعي إلى وعاء تفاعل بلاستيكي ملليلتر اثنين وإضافة العازلة سترات لجعل الحجم النهائي إلى مليلتر اثنين. احتضان أربعة أجهزة استشعار إدراجها في حامل متعددtetrafluoro الإيثيلين في حل 2٪ SDS لمدة 30 دقيقة على الأقل.
ثم يغسل لهم على نطاق واسع مع المياه النقية جدا لإزالة تماما SDS ومحاولة لهم باستخدام تيار من الأرجون الجاف أو النيتروجين. استخدام نظام تنظيف البلازما لإزالة تماما أي الملوثات. للقيام بذلك، أدخل أجهزة الاستشعار الجافة في غرفة تنظيف البلازما، وإخلاء الغرفة، ومسحها ثلاث مرات مع الأكسجين.
ثم، تشغيل منظف البلازما. استخدام فراغ، وارتفاع طاقة الترددات الراديوية، و 10 دقيقة من وقت العملية. بعد تشغيل التنظيف، إيقاف تشغيل الجهاز والخروج أجهزة الاستشعار.
قم بإرساء أجهزة الاستشعار التي تم تنظيفها بالبلازما بعناية في غرف التدفق الأربعة باستخدام الملاقط. تجنب أي ضغط على أو التواء من الغرف والأنابيب التي قد تسبب تسرب. قم بمسح النظام بمخزن citrate المؤقت في وضع التدفق المفتوح لمدة 10 دقائق.
إطلاق البرنامج. ابدأ في تسجيل أي تغييرات في التردد وتبديد النغمة الأساسية الأولى والإيغام باستخدام البرنامج حتى تصبح خطوط الأساس للتردد وتبديدها ثابتة. عندما تكون خطوط الأساس مستقرة، تطبيق تعليق SUV في العازلة سترات.
باستخدام وعاء رد فعل، إزالة 1.5 ملليلتر من حجم الميت، ثم إغلاق النظام في وضع تدفق الحلقة. سجل تحول تبدد التردد لمدة 10 دقائق أخرى. عندما يكون SLB مستقرًا، اُجري توازنًا في النظام مع مخزن مؤقت في تركيزات الكالسيوم المطلوبة في وضع التدفق المفتوح لمدة 40 دقيقة.
إضافة البروتين إلى المخزن المؤقت الذي يحتوي على الكالسيوم. تنفيذ تطبيق البروتين في وضع تدفق حلقة حتى يتم التوصل إلى حالة ثابتة التوازن. الآن، افصل البروتين المقيد عن طريق chelating أيونات الكالسيوم مع خمسة ملليمولار EGTA في المخزن المؤقت قيد التشغيل في وضع التدفق المفتوح.
تجديد نظام الثقل الدقيق مع 50 ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة في وضع التدفق المفتوح المستمر. إزالة الأنابيب من حاوية المياه والسماح للنظام تشغيل الجافة. قم بإزالة مستشعر الكريستال بعناية وانظفه باستخدام محلول SDS بنسبة 2٪ باستخدام حامل البوليtetetrafluoroethylene.
جفف الأجزاء المرئية من وحدة التدفق الداخلية حيث تم وضع المستشعر. يظهر هنا، هو تسجيل منحنى التردد وتبديدات التبدد. الانخفاض البارز في التردد عند إضافة الليبوزومات ، يشير إلى امتصاصها لأن الحويصلات المملوءة العازلة ليست جامدة ولكنها فيزيائية ، يزيد التبدد.
في وقت لاحق، تمزق الفينات. الافراج عن ما يصاحب ذلك من العازلة داخل الحويصلات يقلل من كتلة مُمتزة حتى يتم التوصل إلى هضبة مستقرة. إن ربط Annexin A2 بالدهون يضيف كتلة كما يراها تحول التردد الواضح، ولكنه لا يتعارض مع بنية الطبقات الثنائية كما هو مبين في التغير الصغير الوحيد في التبدد.
عندما تتم إزالة أيون الكالسيوم من قبل وكيل chelating، EGTA، الملحق A2 ينفصل عن فيلم الدهون. التردد وتبديد التسجيلات التحول إلى المستويات التي ينظر إليها مع bilayer تشير فقط إلى الملحق A2 ملزمة كليا تعتمد على أيون الكالسيوم وأن الفيلم الدهون لا تزال سليمة. تظهر هنا تجربة تحكم سالب تمثيلية.
عندما phosphatidylserine غير موجود، لا توجد تغييرات في التردد أو تبديد واضحة بعد إضافة الملحق A2 في وجود أيون الكالسيوم. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم ضمان تشكيل ثنائي الطبقات السليم. استخدام الليبوسومات على الفور، وإلا فإن الحويصلات الصغيرة تصهر في أكبر منها مع التوتر السطحي أقل التي يمكن أن تؤدي إلى خط أساس غير مستقر.
بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء وصف كمي لتفاعل البروتين الغشاء من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التعاونية مقابل غير التعاوني ملزمة.
الموجز
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لتحديد تقاربات الارتباط وأنماط التفاعل لـ annexin A2 مع الطبقتين الثنائية الداعمة الصلبة. تسمح الطريقة بملاحظة تفاعلات البروتين مع أغشية الدهون في الوقت الفعلي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- الفيزياء الحيوية
الخلفية
- Annexin A2 هو بروتين مرتبط بالفوسفوليبيد.
- فهم تفاعلاته مع أغشية الدهون أمر حاسم للعملية الخلوية.
- تركز الدراسة على الارتباط المعتمَد على الكالسيوم بالفوسفوليبيدات سالبة الشحنة.
- الطريقة خالية من التسمية وتسمح بقياسات حساسة وكمية.
غرض الدراسة
- لتحليل تفاعلات ارتباط annexin A2 مع الطبقتين الثنائية المدعومة بالصلب.
- لتوفير بروتوكول تجريبي مفصل للباحثين.
- لإظهار قابلية تطبيق الطريقة على أنظمة معقدة أخرى.
الطرق المستخدمة
- تحضير الطبقات الثنائية الداعمة الصلبة (SLB).
- استخدام ميزان بلورة الكوارتز لقياس امتصاص الكتلة والخصائص اللزوجة-المرونة.
- المراقبة في الوقت الفعلي لتغيرات التردد والتبديد.
- ارتباط أيون الكالسيوم لدراسة تفكك البروتين.
النتائج الرئيسية
- ارتباط annexin A2 بالدهون يعتمد على الكالسيوم.
- تشير تحولات التردد إلى تغييرات في الكتلة عند ارتباط البروتين.
- يتم الحفاظ على هيكل الطبقة الثنائية المستقر أثناء التفاعل.
- تؤكد تجارب التحكم السلبية على خصوصية الارتباط.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول وصفًا كميًا لتفاعلات بروتين الغشاء.
- التحليل في الوقت الفعلي يسمح برؤى مفصلة حول آليات الارتباط.
- يمكن تكييف هذه الطريقة لدراسة تفاعلات البروتين-الدهون الأخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This label-free, real-time technique enables quantitative assessment of protein-lipid binding dynamics, supporting target validation in membrane-associated pathways. By measuring mass and viscoelastic changes, it provides mechanistic insights into calcium-dependent interactions critical for de-risking early-stage targets. The method supports predictive confidence in screening campaigns by delivering reproducible, quantitative data on binding affinity and specificity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving phospholipid-binding proteins like annexin A2.
- Operational Value: Provides label-free, quantitative measurement of binding kinetics and calcium dependence.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming specific, reversible interactions with lipid bilayers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates robust, reproducible data for assay standardization in membrane protein screening.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of binding events, facilitating hit confirmation and SAR development.
- Scalability: Compatible with diverse lipid compositions and protein targets, supporting platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by maintaining native-like lipid environments.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed effects stem from specific binding or nonspecific adsorption.
- Biomarker Alignment: Supports evaluation of target engagement in disease-relevant systems when linked to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, particularly for peripherally acting or membrane-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying calcium-dependent binding to anionic lipids.
- Screening: Delivers quantitative frequency and dissipation shifts as primary readouts for compound or mutant evaluation.
- Analytics: Enables comparison of binding affinity, stoichiometry, and reversibility across conditions.
- Translational Research: Maintains structural integrity of lipid bilayers, supporting extrapolation to cellular contexts.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other membrane-binding proteins and lipid systems, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-lipid interaction studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized SLB formation and real-time monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target specificity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated binding mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid vesicle preparation and quartz crystal microbalance operation.
- Depends on access to extrusion equipment, plasma cleaners, and fluidic flow systems.
- Necessitates cross-team standardization of buffer conditions, calcium concentrations, and regeneration protocols.
- Adaptation to different models requires validation of lipid composition and protein stability under assay conditions.
- Practical limitations include sensitivity to vesicle aggregation and baseline drift if SLB formation is suboptimal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Lipid Vesicle Preparation and Handling the Quartz Sensors
3:03
Microbalance Operation and Cleaning
5:17
Results: Changes in Frequency and Dissipation during Bilayer formation and the Reversible Ca2+-Dependent Interaction of Annexin A2 with the Lipid Bilayer
6:36
Conclusion
