قياس تركيز أيون في طبقة الحدود أونستيرريد مع ماصة المشبك التصحيح مفتوحة: تدفق الآثار في السيطرة على قنوات أيون بالسوائل
يناير 7, 2019
غالباً ما تتم دراسة قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي من حيث تدفق السائل/القص قوة حساسية مع تسجيل التصحيح-المشبك. مع ذلك، يمكن النتائج المتعلقة بأنظمة تدفق السائل من قنوات أيون تبعاً للبروتوكول التجريبي، والخاطئة. هنا، نحن نقدم طرق لمنع وتصحيح مثل هذه الأخطاء مع أساس نظري.
يمكن أن يساعد هذا الطرح في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الكهربائي الفسيولوجي، مثل تدفق السوائل في لوائح القنوات الأيونية فقط. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقدير التركيز الأيوني الفعلي في طبقة الحدود غير ثنائية من سطح الغشاء لتفسير البيانات المتعلقة بتنظيم تدفق السوائل للقنوات الأيونية. لبدء هذا الإجراء، ثني أنبوب الشعيرات الدموية الزجاجي النار لتشكيل شكل U.
يجب أن يكون القطر الداخلي للشعر الشعري كبيرًا بما يكفي لتقليل مقاومة السلسلة عند تسجيل التيارات الأيونية الكبيرة. بعد ذلك، قم بحل ثلاثة غرامات من الأاغروز في 100 ملليلتر من كلوريد البوتاسيوم ثلاثي المولر، ووضعها على صفيحة ساخنة بين 90 و 100 درجة مئوية. ثم، تحميل الجسر مع كلوريد البوتاسيوم agarose، عن طريق غمر الجسر الزجاجي في الحل.
يبقيه بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لأغاروز لتعيين وتصلب. في اليوم التالي، قم بحفر جسر أغاروز كلوريد البوتاسيوم المحملة بكلوريد من ملح agarose المتصلب. تخزين الجسر في زجاجة واسعة العنق من كلوريد البوتاسيوم ثلاثة المولار في الثلاجة.
في هذا الإجراء، ضع حاوية محملة بمحلول الاستحمام، فوق حجرة المشبك. المقبل، ملء غرفة التصحيح المشبك مع حل الاستحمام عن طريق شفط الأنبوب. لوقف تدفق السوائل، مقطع الأنبوب على جانب الحاوية، لمنع تدفق السوائل.
ثم مقطع الأنبوب في الجانب شفط لوقف الشفط في نفس الوقت. هذه هي حالة التحكم الثابتة. لتطبيق تدفق السوائل قوة القص، وفتح كلا الأنابيب على جانبي الحاوية والشفط في نفس الوقت.
قبل أو بعد تطبيق تدفق السائل قوة القص إلى الخلية، وحساب معدل التدفق في المليلتر في الدقيقة الواحدة عن طريق قياس الانخفاض في حجم السوائل على مدى وقت معين. لقياس التغيرات في إمكانات تقاطع المعادن السائلة، وإعداد المالحة الفسيولوجية الطبيعية لغرفة الاستحمام، ومقارنتها في غياب وجود جسر كلوريد البوتاسيوم أجار. بعد ذلك، ضع ماصة التصحيح التي تحتوي على محلول كلوريد البوتاسيوم ثلاثة المولر في الغرفة، لتقليل التحول المحتمل تقاطع بين الماصات وحلول الاستحمام.
ثم تعيين مضخم الجهد المشبك إلى وضع المشبك الحالي. بعد إبطال إمكانات الإزاحة الأولية، قم بقياس التغيرات في الجهد الناتج عن اختلاف معدلات التدفق. للتحقق من أن التغيرات في الجهد الكهربائي هي إمكانات تقاطع المعادن السائلة، إعادة النظر في تأثير تدفق السوائل على إمكانية تقاطع، وذلك باستخدام جسر الملح agarose بين محلول الحمام والأقطاب المرجعية.
مع نتائج التغيرات في إمكانات تقاطع المعادن السائلة، رسم الدالة المحتملة علاقات معدل التدفق، وتقدير القيمة المشبعة من التحول المحتملة الوصلة من قبل معدل التدفق فوق السوائل. ثم، تغيير تركيز كلوريد في سائل الاستحمام، ورسم وصلة احتمالية علاقة تركيز كلوريد. لاحظ أن معدل السائل يجب أن يكون ثابتاً، وعالياً بما فيه الكفاية لمنع انخفاض تركيز الكلوريد إلى القطب المرجعي للكلوريد الفضي والفضي المجاور.
من منحنيات العلاقة اثنين، تقدير التغيرات في تركيز كلوريد من التحول المحتمل الوصلة قياس. تم تسجيل التيارات VDCC-L في الفئران المنتشرة الأنزيمية mesenteric myocytes الشرايين، مع تسجيل nystatin مثقب التصحيح المشبك. مع جسر كلوريد البوتاسيوم agarose، يمكن تقليل إمكانات التقاطع بين القطب المرجعي وحلول الاستحمام، وزيادة تدفق السوائل الجهد VDCC-L الحالي بشكل مستقل.
ومع ذلك، عندما كان القطب المرجعي للكلوريد الفضي والفضة متصلاً مباشرة بسائل الاستحمام، دون جسر كلوريد البوتاسيوم agarose، تحولت العلاقة IV في وجود تدفق السوائل إلى اليمين، مقارنة بتلك التيارات VDCC-L في ظل حالة ثابتة. يمكن تفسير الزيادة الناجمة عن تدفق السوائل من تيارات كير 2.1 ، والتي تم تسجيلها في خلايا سرطان الدم القاعدي للفئران مع جسر agarose ، بتأثير الطبقة غير المنتهكة. بعد تطويره، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في أكثر من علم وظائف الأعضاء الكهربائية.
لذلك هو لتنظيم تدفق السوائل في التيارات قناة أيون. من حيث الظواهر الكهروكيميائية، في طبقة الحدود غير ثنائية في سطح غشاء الخلية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة أهمية القياس الدقيق لتدفق السوائل وتأثيراته على القنوات الأيونية الحساسة للميكانيكا، كما تقدم طرقاً لمنع وتصحيح الأخطاء في البروتوكولات التجريبية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الفيزيولوجيا الكهربائية
- القنوات الأيونية الحساسة للميكانيكا
- ديناميكا السوائل
خلفية علمية
- تعد القنوات الأيونية الحساسة للمؤثرات الميكانيكية بالغة الأهمية لفهم الاستجابات الخلوية للمحفزات الميكانيكية.
- يمكن أن تؤدي الأخطاء في قياس تدفق السوائل إلى استنتاجات غير صحيحة حول سلوك القنوات الأيونية.
- يعد تسجيل تثبيت الرقعة (Patch-clamp) تقنية شائعة الاستخدام في هذه الدراسات.
- إن فهم الطبقة الحدية غير المحركة أمر ضروري للتفسير الدقيق للبيانات.
الغرض من الدراسة
- توفير طرق للقياس الدقيق لتأثيرات تدفق السوائل على القنوات الأيونية.
- تسليط الضوء على الأخطاء المحتملة في البروتوكولات التجريبية الحالية.
- تعزيز فهم ديناميكيات تركيز الأيونات بالقرب من أسطح الغشاء.
الطرق المستخدمة
- استخدام أنبوبة شعرية من الزجاج المقسى على شكل حرف U لقياس تدفق السوائل.
- إذابة الأجاروز في كلوريد البوتاسيوم لإنشاء جسر للتسجيل.
- تسخين محلول الأجاروز لضمان القوام المناسب.
- تعبئة الجسر بأجاروز كلوريد البوتاسيوم لتسجيل تيار أيوني فعال.
النتائج الرئيسية
- تؤدي الطرق المقترحة إلى تحسين دقة قياسات تدفق السوائل.
- تؤدي البروتوكولات المصححة إلى فهم أفضل لتنظيم القنوات الأيونية.
- يتم تحقيق تقدير تركيز الأيونات في الطبقة الحدودية غير المحركة.
- تظهر النتائج أهمية الإعدادات التجريبية الدقيقة.
الاستنتاجات
- تعد تقنيات القياس الدقيقة حيوية لدراسة القنوات الأيونية الحساسة للميكانيكا.
- يمكن تقليل الأخطاء في تنظيم تدفق السوائل من خلال اتباع بروتوكولات مناسبة.
- تساهم هذه الدراسة في مجال الفيزيولوجيا الكهربائية عن طريق تحسين الطرق التجريبية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يعد القياس الدقيق لتركيز الأيونات في الطبقة الحدودية غير المحركة أمراً بالغ الأهمية للتفسير الموثوق لتأثيرات تدفق السوائل على بوابات القنوات الأيونية. تعالج هذه الطريقة العيوب التجريبية في دراسات الفسيولوجيا الكهربائية، مما يحسن جودة البيانات اللازمة للتحقق من الأهداف في أبحاث القنوات الأيونية الحساسة للميكانيكا. ومن خلال تصحيح انزياحات جهد الوصلة، تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية لاستجابات إجهاد القص للسوائل.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال التمييز بين التنظيم الحقيقي للقنوات الأيونية والنتائج الاصطناعية الناجمة عن تدفق السوائل.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء في القراءات الفيزيولوجية الكهربائية.
- القيمة التنبؤية: تزيد الثقة في تحديد المركبات الرائدة عن طريق تقليل النتائج الإيجابية الكاذبة الناتجة عن تأثيرات الطبقة غير المحركة.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تعمل على تحضير الأنظمة البيولوجية المعتمدة للفحص اللاحق عن طريق تثبيت قياسات تركيز الأيونات بالقرب من الغشاء.
- قابلية التكرار: تعالج مصدراً رئيسياً للتفاوت في مقايسات تثبيت الرقعة (patch-clamp)، مما يدعم توحيد المقايسات عبر المختبرات المختلفة.
- المخرجات الكمية: تتيح قياس تراكيز الأيونات الحقيقية في الطبقة الحدودية غير المقلبة، مما يحسن دقة علاقات التركيز والاستجابة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: تربط الفيزيولوجيا الكهربائية في مرحلة الاكتشاف بالتحقق من الصلاحية قبل السريرية من خلال ضمان نمذجة متسقة للبيئة الأيونية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: توضح ما إذا كانت التغيرات الملحوظة في القنوات الأيونية تعود إلى الحساسية الميكانيكية المباشرة أو آثار استنزاف الأيونات الثانوية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: تدعم قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) من خلال تحسين موثوقية إشارات الفعالية والسلامة قبل السريرية.
تكامل مسارات العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشاف التي تبدأ من التحقق من الهدف، مروراً بتحسين المركبات الرائدة، وصولاً إلى التقييم قبل السريري، وتحديداً للقنوات الأيونية التي يتم تنظيمها بواسطة المحفزات الميكانيكية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال عزل مساهمة تحولات تركيز الأيونات مقابل البوابة المباشرة للقنوات في تجارب تدفق السوائل.
- الفحص: تعزز جاهزية المقايسة وقابلية تكرارها عند تقييم المركبات التي تستهدف القنوات الأيونية الحساسة للتدفق.
- التحليلات: توفر قياسات كمية لتحول جهد الوصلة مما يتيح تقدير تركيزات الأيونات في الطبقة المتاخمة.
- البحث الانتقالي: تحسن الاستمرارية في مرحلة ما قبل السريرية من خلال ضمان أن استجابات القنوات الأيونية في المختبر تعكس ظروفاً ذات صلة فسيولوجياً.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس قدرة في الفيزيولوجيا الكهربائية قابلة لإعادة الاستخدام لدراسة أي هدف من القنوات الأيونية الحساسة للميكانيكا عبر المجالات العلاجية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي في دراسات تنظيم القنوات الأيونية من خلال مراعاة تأثيرات الطبقة غير المحركة.
- القيمة التشغيلية: يزيد من قابلية التكرار والتوحيد القياسي لتجارب تثبيت الرقعة (patch-clamp) تحت ظروف تدفق السوائل.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن كفاءة رأس المال عن طريق تقليل الدراسات المتابعة الفاشلة الناتجة عن البيانات الاصطناعية.
- تأثير المحفظة: يتيح تحديد أولويات أهداف القنوات الأيونية المعدلة حسب المخاطر بناءً على بيانات ميكانيكية أكثر موثوقية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الفيزيولوجيا الكهربائية وديناميكا السوائل لتنفيذ التحكم في التدفق وقياسات جهد الوصلة بشكل صحيح.
- يعتمد على أجهزة قادرة على التحكم الدقيق في معدل التدفق وتسجيل تثبيت الجهد في وضع تثبيت التيار.
- يستلزم توحيد معايير تحضير جسر الأغاروز وتكوين محلول الاستحمام بين الفرق البحثية.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند تطبيق هذه الطريقة على أنواع خلايا مختلفة أو أهداف مختلفة من القنوات الأيونية.
- يشمل قيوداً عملية مثل الحاجة إلى الحفاظ على معدلات تدفق عالية بما يكفي لمنع نضوب الكلوريد بالقرب من القطب المرجعي.
الأسئلة الشائعة حول المستحضرات الصيدلانية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Title
0:30
Agarose Salt Bridges Between the Bath Solution and Reference Electrode
1:29
Application of Fluid Flow Shear Force to Cells in a Patch-Clamping Chamber
2:21
Measuring Changes in Liquid-Metal Junction Potential
3:18
Experimental Estimation of Real Chloride Concentration
4:07
Results: Effects of Fluid Flow on L-type VDCCL and Kir2.1 Currents With and Without Agarose 3 M KCl Bridge
5:14
Conclusion
