في الوقت الحقيقي في فيفو تتبع الثيموسيه في الغرفة الأمامية للعين بالليزر الفحص المجهري

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة حول آليات المناعة الذاتية، نقص المناعة، والتسامح المركزي، وthymus involution. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح في تسجيل طولي الجسم من تجنيد السلف وناضجة T-خلية الخروج داخل شرائح الغدة الصعترية الماوس المطعمة الوعائية والمطعّمة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تطوير ووظيفة الغدة الصعترية، ويمكن أيضا أن تطبق على الأنسجة الأخرى مثل الجزر البنكرياسية أو كبيبات الكلى.

لعزل الغدة الصعترية، ضع الماوس على مناشف ورقية ممتصة معقمة في وضع الظهر المستقيم في غطاء تدفق لاريم، ورش ومسح البطن الماوس مع 70٪ الإيثانول. إجراء شق سطحي على شكل حرف V في أسفل البطن لفضح تجويف الصدر واستخدام مقص تشريح مستقيم بطول 10 سنتيمترات لإجراء شق من 0.5 إلى سنتيمتر واحد في الصدر على طول خط الوسط البطني. أضعاف الجلد على كل جانب من الصدر لفضح تجويف الصدر وجعل اثنين إضافية أعمق 0.5 إلى شقوق جانبية سنتيمتر واحد من خلال الحجاب الحاجز والقفص الصدري للوصول إلى توستينوم متفوقة في تجويف الصدر الأمامي.

يجب أن تظهر الغدة الصعترية كفصين شاحبين فوق القلب مباشرة. ضع منحنية النصائح الزلاجة تحت الغدة الصعترية وسحب عموديا لاستخراج الجهاز الكامل، ومنع أضعاف الظهر من القفص الصدري مع زوج من ملقط مستقيم. ثم غمر الغدة الصعترية المعزولة في طبق عقيم 60 ملليلتر يحتوي على PBS معقمة الباردة على الجليد واستخدام مشرط لقطع البرزخ الضامة لفصل الفصوص الغدة الصعترية.

قبل زرع, الوسم ووزنها كل الماوس المتلقي ووضع أول في موقف الجانبي recumbent الجانبية مع عين واحدة تتعرض مباشرة لعدسة المجهر تشريح. باستخدام مقص Vannas ، يُزيل أحد الفصوص الزعتية المعزولة التي يصل عرضها إلى ملليمتر واحد بعد نمط متعرج لضمان أن يحتوي كل جزء على بعض القشرة الزعتية وأنسجة النخاع. من الأهمية بمكان تقليم الغدة الصعترية الحق قبل زرع كما قد لا تنقّر قطع كبيرة بشكل صحيح.

بعد ذلك ، بدءًا من قاعدة القرنية في المنطقة الجراحية ، استخدم طرف إبرة قياس 40 ملليمترًا من 18 إلى إجراء شق صغير في طبقات القرنية الخارجية بحيث يمكن إدخال طرف مقص تشريحي. استخدم المقص لإجراء شق جناح من 5 إلى 10 ملليمترات حول قاعدة القرنية مباشرة أثناء استخدام ملقط مسطح النهاية لعقد القرنية مفتوحة لمنع إعادة المسك. استيعاب ظهارة القرنية المقطوعة مع ملقط مسطحة، والحفاظ على الفتحة في القرنية مع إدخال جزء من الزعتر من خلال الفتحة.

من المهم إدخال قطعة الغدة الصعترية بسرعة من خلال فتحة القرنية لمنع إعادة الراسل التلقائي قبل إدخال الأنسجة. كن حذرا للحفاظ على سلامة الأنسجة في هذه الخطوة. اضغط بهدوء على سطح العين لشريحة الجزء المقدم من الأنسجة إلى موقف جانبي فيما يتعلق بالتلميذ للحفاظ على وظيفة العين.

واستخدام ملقط شقة للضغط على جانبي فتحة القرنية بحزم ضد بعضها البعض لمدة ثلاث إلى خمس ثوان لتعزيز الختم الذاتي. إذا كان لعملية الزرع أن يتم إجراؤها على كلتا العينين، قم بتشغيل الماوس على الجانب الجانبي المقابل من أجل عملية زرع ثانية كما هو موضح للتو. عند اكتمال الجراحة، ارجع الماوس إلى قفص فارغ تم تدفئته مسبقًا بمصباح حراري مع مراقبة حتى إعادة شغل الوظائف بالكامل.

عند نقطة الوقت التجريبية المناسبة، ضع فأرة مستلم مُجلّد على منصة مجهر ثابتة المراحل في موضع جانبي جانبي على لوحة حرارية مع عين واحدة مواجه لأعلى. وأدخل رأس الماوس في حامل رأس مجسم. ضبط مقبض الباب لكبح جماح رأس الماوس في موقف الجانب الجانبي للسماح بالوصول المباشر لهدف المجهر إلى العين عقد الكسب غير المشروع الغدة الصعترية وسحب الجفون في حين عقد العين في هامش القرنية مع زوج من النصائح الملقطة التي تغطيها أنبوب البولي ايثيلين تعلق على مشترك يو إس تي-2 الصلبة العالمية.

إضافة بضع قطرات من الدموع المالحة العقيمة أو الاصطناعية بين القرنية والعدسة قبل وضع الهدف 5X المجهر على العين الماوس وتحديد موقع الغدة الصعترية في مجال المجهر. ثم التبديل إلى أعلى القرار المياه غمر الهدف مع مسافة عمل طويلة وحدد وضع الاستحواذ في برنامج المجهر. ابدأ وضع الماسح الضوئي الرنين وحدد وضع التصوير XYZT.

بدوره على الليزر الأرجون وضبط الطاقة إلى 30٪ لالإثارة الفلورانس. حدد خط ليزر الإثارة المناسبة وتعيين التحكم في تقسيم شعاع acousto البصرية لأطوال موجية الانبعاثات المناسبة باستخدام الكشف عن الانعكاس في وقت واحد للكشف عن backscatter وتحديد هيكل الأنسجة. جمع الانبعاثات في الطول الموجي المحدد وتعيين دقة 512-by-512 بكسل.

ثم انقر مباشرة لبدء التصوير ، وضبط مستويات كسب حسب الضرورة. التركيز على الجزء العلوي من زرع الزعتر وحدد تبدأ في تحديد بداية المكدس Z. ثم التركيز على الطائرة الأخيرة في الغدة الصعترية المزروعة التي يمكن تصورها وتحديد نهاية لتحديد نهاية المكدس Z باستخدام حجم Z-الخطوة من خمسة ميكرومتر.

تعيين الفاصل الزمني للحصول على كل مكدس Z لمدة 1.5 إلى ثانيتين وحدد خيار الحصول حتى إيقاف للتصوير المستمر. ثم انقر فوق بدء تهيئة التسجيل. هنا، تظهر صور الحقل الساطع وفلوريسنس لنفس المنطقة من زرع الغدة الصعترية التي قد تعمل لمتابعة مزدوجة العيانية لنمو الأنسجة والدراسات التثاؤب والاستمرار.

كما تسهل الصورة ذات المجال الساطع تصور الأوعية الدموية للأنسجة المزروعة ، مما يسمح بإجراء دراسة فريدة لاعتماد فسيولوجيا الغدة الصعترية على إمدادات الدم بمرور الوقت. يسمح هذا النموذج بالتصور من الهجرة عبر الخلايا من سيل الدم إلى الغدة الصعترية المزروعة، وتتبع الاتصالات بين الخلايا السلفة إيجابية GFP دخول زرع الغدة ثعرية مع RFP المسمى المقيمين ظهارية والخلايا السترومية خلال عمليات التمايز والاختيار، فضلا عن رصد الخلايا المناعية الخارجة من الغدة الصعترية إلى الأوعية الدموية الطرفية. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر تقليل تعرض الأنسجة للحصول على أفضل الengraftment وكذلك للحد من حجم الشق في العين للسماح بالاستئصال لأجزاء سالمة من خلال القرنية مع الحد من التليف أثناء الشفاء.

بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل علاجات التحكم الموضعية وشق الأنسجة الأخرى في العين المقابلة بحيث يمكن الإجابة على أسئلة إضافية حول الخلل المناعي المرتبط بالالتهابات، ومحددات الإنفاض، وآليات تحمل الزرع. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف تطوير الخلايا التى ، بما في ذلك تجنيد السلف ، وديناميات عين الغدة الصعترية ، وخطوات الخروج الناضجة من الخلايا التى في الجسم الحي.