جيل خلايا المغلوب الأساسية والموسعة ناغورني كاراباخ البشرية باستخدام ريبونوكليوبروتينس Cas9
يونيو 14, 2018
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتعديل الخلايا الأساسي أو الموسع البشرية القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ) ريبونوكليوبروتينس Cas9 (Cas9/رنبس) باستخدام جينياً. باستخدام هذا البروتوكول، أنشأنا ناغورني كاراباخ الخلايا البشرية قاصرة تحويل مستقبلات عامل النمو – ب 2 (TGFBR2) هيبوكسانثيني فوسفوريبوسيلترانسفيراسي 1 (HPRT1).
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلايا القاتلة الطبيعية حول دور ووظيفة جينات ومسارات معينة تنظم وظيفة الخلية المستجيبة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي معدل نجاحها المرتفع مقارنة بالأساليب المعتمدة على الحمض النووي مما يسهل ضربة قاضية عالية الكفاءة لأحد أكثر الجينات ذات الصلة سريريا في العلاج بالخلايا القاتلة الطبيعية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج المناعي للأورام الصلبة وأورام المخ التي تعبر عن TGF-beta كوسيلة للهروب المناعي.
بالنسبة لنقل الخلايا القاتلة الطبيعية الأولي ، احتضان ثلاث مرات 10 إلى خمس خلايا NK المعزولة حديثا لكل مليلتر من وسط RPMI مكمل ب 100 وحدة دولية لكل مليلتر من IL2 لكل قارورة T75 لمدة أربعة أيام لتحل محل الوسط كل يومين واليوم السابق للتنبيغ. لنقل الخلايا القاتلة الطبيعية الموسع ، قم بتحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية الأولية في اليوم صفر باستخدام خلايا تغذية K562 المرتبطة بالغشاء IL21 المشعة بنسبة واحد إلى واحد لتحل محل الوسط كل يومين واليوم السابق للتحويل. في يوم التثقيب الكهربائي ، املأ قارورة T25 واحدة بثمانية ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج مع 100 وحدة دولية لكل مليلتر من IL2 لكل حالة خلية تجريبية وضع القوارير في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
بينما يكون الوسط متوازنا ، أضف ثلاثة إلى أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل حالة لكل 26 ميكرولترا من مزيج التنبيغ في أنبوب مخروطي الشكل وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات في 12 مل من PBS المعقم لكل غسلة لإزالة كل FBS من معلقات الخلية. أثناء غسل الخلايا ، أعد تعليق كل CRISPR RNA و tracrRNA إلى 200 تركيز نهائي من الميكرومولار.
امزج 2.2 ميكرولتر من كل كريبر RNA مع حجم واحد 200 ميكرومولار من tracrRNA لكل عينة وقم بتسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم اترك العينات لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتخزين مجمعات CRISPR RNA / tracrRNA عند سالب 20 درجة مئوية حتى استخدامها. لتشكيل مجمعات البروتين النووي الريبي ، أضف نوكلياز Cas9 إلى مركب CRISPR RNA / tracrRNA المناسب مع الدوران لأكثر من 30 إلى 60 ثانية واحتضان مجمعات البروتين النووي الريبي Cas9 الناتجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة.
بعد الغسيل الأخير ، أضف الحجم الكامل لمكملات التثقيب الكهربائي من مجموعة محلول Nucleofector P3 وأعد تعليق كل حبيبات خلية في 20 ميكرولتر من محلول P3 الأساسي 4D-Nucleofector مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء. أضف على الفور خمسة ميكرولترات من كل مركب بروتين نووي ريبي إلى تعليق الخلية المناسب وأضف ميكرولتر واحدا من 100 ميكرومولار محسن التثقيب الكهربائي Cas9 إلى مزيج الخلايا المعقدة للبروتين النووي الريبي Cas9. انقل 26 ميكرولترا من محلول خلية البروتين النووي الريبي Cas9 إلى آبار فردية لشريط Nucleocuvette واضغط برفق على الشريط للتأكد من أن العينات تغطي قاع كل بئر.
ثم ابدأ برنامج نظام 4D-Nucleofector EN138. في نهاية التنبيغ ، اترك الخلايا ترتاح لمدة ثلاث دقائق. ثم أضف 80 ميكرولترا من وسط الاستزراع المتوازن مسبقا إلى كل كوفيت وانقل العينات برفق إلى قارورة واحدة لكل حالة عند 37 درجة مئوية حضانة.
بعد 48 ساعة من الثقافة ، استخرج الحمض النووي الجيني من خمس مرات 10 إلى خمس خلايا محولة لفحص حذف الجينات وفقا للبروتوكولات القياسية. ثم قم بتحفيز بقية الخلايا المنقولة بخلايا مغذية جديدة مرتبطة بالغشاء IL21 بنسبة واحد إلى واحد واستخراج الحمض النووي الريبي بعد خمسة أيام من الزراعة المشتركة وفقا للبروتوكولات القياسية لتحليل التعبير الجيني بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. يكشف تحليل قياس التدفق الخلوي أن برنامج EN138 ينتج عنه أعلى نسبة من قابلية الخلية للحياة وكفاءة التحويل لبرامج نظام Nucleofector المتاحة.
على سبيل المثال ، باستخدام دليل الحمض النووي الريبي المقدم تجاريا ، تم التخلص من HPRT1 البشري بنجاح في الخلايا البشرية الموسعة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتينات النووية الريبية Cas9 التي تحتوي على دليل RNA2 ، ودليل RNA1 بالإضافة إلى دليل RNA2 ودليل RNA3 تظهر مستقبلات TGF-beta ناجحة اثنين من جينات المجال الخارجي بينما لا يحفز دليل RNA1 وحده أي حذف إدخال يمكن اكتشافه T7E1. في الواقع ، يؤدي استخدام برنامج EN138 للتثقيب الكهربائي للبروتين النووي الريبي Cas9 إلى انخفاض بنسبة 60٪ في مستقبلات TGF-beta اثنين من تعبيرات mRNA في الخلايا المنقولة عبر هذا البرنامج.
علاوة على ذلك ، فإن الزراعة المشتركة للخلايا المنقولة مع TGF-beta وخط خلايا الورم الأرومي النخاعي الأولي البشري لا تؤثر بشكل كبير على السمية الخلوية للخلايا NK مقارنة بالخلايا المنقولة غير المعالجة ب TGF-beta ، مما يواجه نقصا مقابلا في وظيفة مستقبلات TGF-beta الثانية في الخلايا المعدلة للبروتين النووي الريبي Cas9 على مستوى البروتين. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تصميم العديد من الحمض النووي الريبي الإرشادي المختلف للعثور على أفضل نتيجة لتحرير الجينات.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الحمض النووي أو مقايسة طفرة T7E1 للإجابة على أسئلة إضافية حول كفاءة تحرير الجينات أو كيفية تحديد الطفرات الجينية المحتملة خارج الهدف. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج المناعي للسرطان لاستكشاف إمكانية استخدام الخلايا الطبيعية المعدلة جينيا في علاج السرطان. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التحرير الجيني لخلايا القاتل الطبيعية البشرية الأولية.
لمزيد من المعلومات حول توسيع الخلايا القاتلة الطبيعية بعد هذه العملية ، يرجى الاطلاع على مقالة Jove السابقة. لا تنس أن العمل بدم الإنسان يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه يجب دائما اتخاذ احتياطات الصحة والسلامة الشاملة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لتعديل الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية (NK) وراثيًا باستخدام بروتينات الريبونوكليوبروتين Cas9 (Cas9/RNPs). تسمح الطريقة بإنشاء خلايا NK ناقصة في TGFBR2 و HPRT1، مما يسهل البحث في بيولوجيا الخلايا القاتلة الطبيعية وعلاج المناعة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم المناعة
- تحرير الجينات
الخلفية
- تلعب الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) دورًا حاسمًا في الاستجابة المناعية.
- يمكن أن يؤدي فهم وظائف الجينات في الخلايا القاتلة الطبيعية إلى تحسين أساليب العلاج المناعي.
- تعاني الطرق الحالية لتحرير الجينات في الخلايا القاتلة الطبيعية من قيود.
- يهدف هذا البروتوكول إلى تحسين كفاءة حذف الجينات في الخلايا القاتلة الطبيعية.
غرض الدراسة
- لتأسيس طريقة موثوقة لتعديل الخلايا القاتلة الطبيعية.
- للتحقيق في أدوار جينات معينة في وظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية.
- لاستكشاف الآثار المترتبة على العلاج المناعي المستهدف للأورام الصلبة.
الطرق المستخدمة
- عزلة وخلط الخلايا القاتلة الطبيعية الأولية في وسط RPMI.
- تحوير الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام IL2 وخلايا مغذيات.
- الكهربائي لإدخال Cas9/RNPs في الخلايا القاتلة الطبيعية.
- تقييم كفاءة حذف الجينات ووظيفيتها.
النتائج الرئيسية
- إنتاج ناجح للخلايا القاتلة الطبيعية ناقصة في TGFBR2 و HPRT1.
- معدل نجاح مرتفع في حذف الجينات مقارنةً بالطرق التقليدية.
- تطبيقات محتملة في تعزيز العلاج بالخلايا القاتلة الطبيعية للأورام.
- رؤى حول آليات الهروب المناعي في الأورام.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة قوية لتعديل الخلايا القاتلة الطبيعية.
- تساهم النتائج في فهم بيولوجيا الخلايا القاتلة الطبيعية والعلاج.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه التقنية للتطبيقات السريرية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Efficient genome editing of primary human NK cells addresses a critical bottleneck in immunotherapy development, enabling mechanistic interrogation of immune evasion pathways such as TGF-beta signaling. This DNA-free Cas9/RNP approach improves target validation confidence by reducing procedure-associated apoptosis and increasing knockout efficiency, supporting de-risking of NK cell-based therapeutics. The method enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation by generating functionally modified NK cells that retain expansion capacity and cytotoxic potential.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in primary human NK cells to clarify roles of TGFBR2 and HPRT1 in effector cell regulation.
- Operational Value: Provides a high-success-rate alternative to viral transduction, minimizing apoptosis and improving yield of genetically modified NK cells.
- Predictive Value: Supports assessment of gene knockout impact on TGF-beta sensitivity, informing mechanistic de-risking of immunotherapy candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates knockout NK cells suitable for functional assays, including cytotoxicity and gene expression analysis via RT-PCR and flow cytometry.
- Operational Value: Enables standardized preparation of edited NK cells using defined electroporation parameters (EN138 program) for reproducible transduction efficiency.
- Scalability: Supports post-electroporation expansion using irradiated mbIL21-expressing feeder cells, facilitating scale-up for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Produces TGFBR2-deficient NK cells with reduced sensitivity to TGF-beta, modeling immune escape mechanisms in solid and brain tumors.
- Preclinical Continuity: Allows co-culture with tumor cell lines (e.g., medulloblastoma) to evaluate functional resistance to immunosuppressive cytokines.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of gene-edited NK cell persistence and function after modification, supporting go/no-go decisions in immunotherapy development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation through gene knockout, enabling screening-ready cell products, and informing preclinical assessment of immunomodulatory resistance.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of gene roles in NK cell effector function, particularly in TGF-beta-mediated immune suppression pathways.
- Screening: Generates assay-ready NK cells with quantifiable outputs (viability, transduction efficiency, gene expression) for compound or condition comparison.
- Analytics: Delivers measurable endpoints including mRNA reduction (60% for TGFBR2), viability rates, and cytotoxicity shifts for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects genetic modification to functional outcomes in tumor co-culture models, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for NK cell editing that can be applied across multiple genetic targets and therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling efficient, DNA-free knockout in primary human NK cells.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization through defined electroporation conditions and feeder cell-based expansion.
- Strategic Value: Reduces biological risk in NK cell therapy development by clarifying gene function and immune escape mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunotherapy targets through mechanistic de-risking of TGF-beta resistance pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary NK cell isolation, culture, and electroporation techniques.
- Dependent on access to Nucleofector 4D system, Cas9 protein, and synthetic guide RNAs.
- Necessitates standardization of guide RNA design and validation across targets to ensure editing efficiency.
- Involves optimization of cell-to-complex ratios and incubation timing for RNP formation and delivery.
- Limited by primary NK cell donor variability and expansion potential post-electroporation.
