توصيف ميكروبيومي التجزئة بالتسلسل Amplicon الرنا الريباسي 16S الجيل المقبل

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيئة الأمراض المنقولة بالنواقل مثل ، ما هو الدور الذي يلعبه ميكروبيوم الناقل في ديناميكيات مسببات الأمراض ، وكيف تتشكل الميكروبيوم الناقل وتتختلف؟ تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بالنسخ المتماثل العالي والدقة العالية وتحديد الهوية ، مما يسمح للمستخدم بتوصيف الميكروبيوم الناقل بدقة في ظل ظروف بيئية وبيئية مختلفة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا مهما ، حيث يصعب تعلم خطوات إعداد تسلسل الميكروبيوم ، وهناك العديد من المنتجات والتقنيات المختلفة المتاحة ، ولكن القليل من الموارد المتاحة لتعلم هذه الخطوات.

ابدأ هذا الإجراء بتجميع علامات التجزئة، كما هو موضح في بروتوكول النص. لإزالة الملوثات السطحية من القراد ، أضف 500 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين ، والدوامة لمدة 15 ثانية. كرر هذا الغسيل مع 70٪ من الإيثانول ، ثم الماء المقطر المزدوج.

ضع القراد في أنبوب PCR جديد ، واتركه يجف في الهواء. في هذا الأنبوب ، قم بتعطيل أنسجة القراد ميكانيكيا عن طريق سحق القراد بقاتل ومدقة. تنقية الحمض النووي من القراد الفردي ، باتباع التعليمات الواردة في مجموعة استخراج الحمض النووي المتوفرة تجاريا.

بتقطيعه إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر. يعد إنشاء تحكم سلبي في خطوة الاستخراج أمرا بالغ الأهمية للتمييز لاحقا بين الملوثات المشتبه بها والميكروبات النواقلية الحقيقية. يعد استخدام تقنية معقمة أثناء خطوة الاستخراج وخطوات تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحقة أمرا ضروريا أيضا لتقليل تأثير التلوث الشائع في تسلسل 16S.

قم بإعداد Amplicon PCR في تفاعل 27.5 ميكرولتر يحتوي على خمسة ميكرولترات من كل برايمر عند ميكرومولار واحد و 12.5 ميكرولتر من مزيج PCR المتاح تجاريا. قم أيضا بتضمين خمسة ميكرولترات من الحمض النووي المستخرج من القراد الفردي بتركيز خمسة نانوغرام لكل ميكرولتر. انقل الأنابيب إلى جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل البرنامج المدرج في بروتوكول النص.

بمجرد الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تصور منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق تحميل أربعة إلى ستة ميكرولتر لكل عينة على جل الاغاروز بنسبة 1.5٪. ابحث عن نطاق عند 460 زوجا أساسيا لتأكيد التضخيم. باستخدام أنبوب PCR جديد لكل عينة ، اجمع منتج PCR مع الماء المقطر المزدوج للحصول على إجمالي 60 ميكرولترا.

بالنسبة للعينات ذات تركيزات الحمض النووي المنخفضة ، قم بإجراء Amplicon PCR في ثلاث نسخ لتقليل تحيز التضخيم وتجميع العينات للتركيز. أحضر الخرز المغناطيسي إلى درجة حرارة الغرفة وقم بدوامها جيدا قبل الاستخدام. أضف 48 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي إلى 60 ميكرولترا من العينة واحتضنه لمدة خمس دقائق.

ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة خمس دقائق حتى يصبح المحلول صافيا. ثم قم بإزالة المادة الطافية. مع وجود أنابيب على الرف المغناطيسي ، أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪.

مباشرة بعد إضافة الإيثانول إلى جميع الأنابيب ، قم بإخراج السائل ، ولا تقم بإزالة الخرز. كرر إضافة الإيثانول وإزالته مرة أخرى. جفف العينات بالهواء لإزالة الإيثانول الزائد عن طريق ترك الأنابيب مفتوحة على الرف المغناطيسي لمدة خمس دقائق أو حتى تظهر تشققات صغيرة في الخرز.

الآن ، أضف 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت TE واحتضان العينات من المغناطيس في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس إلى 10 دقائق ، ضع الأنابيب مرة أخرى على المغناطيس. بمجرد فصل الخرزات والسائل ، انقل المواد الطافية إلى أنبوب جديد للحصول على منتج PCR الذي تم تنظيفه.

قم بتعيين مجموعات أولية فريدة لكل عينة، عن طريق تحديد إما بادئات أمامية أو خلفية أو كليهما من مجموعة فهرس المكتبة المتوفرة تجاريا. لإرفاق البادئات أو المؤشرات المزدوجة بالعينات ، قم بإعداد تفاعل PCR يحتوي على 2.5 ميكرولتر من كل برايمر ، و 12.5 ميكرولتر من PCR Master Mix المتاح تجاريا ، وخمسة ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج ، و 2.5 ميكرولتر من منتج Amplicon النظيف. انقل الأنابيب إلى جهاز تدوير حراري مبرمج كما هو مفصل في بروتوكول النص.

بمجرد الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تصور منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق تحميل أربعة إلى ستة ميكرولتر لكل عينة على جل الاغاروز بنسبة 1.5٪. ابحث عن نطاق عند 550 زوجا أساسيا لتأكيد التضخيم قبل تنفيذ إجراء التنظيف كما كان من قبل. لإجراء تقدير دقيق لكل منتج مشفر منقى ، قم بتشغيل qPCR على كل عينة ومعيار ثلاث نسخ وقم بتشغيل كل عينة بثلاثة مستويات أو أكثر من مستويات التخفيف.

قم بإعداد تفاعلات qPCR سعة 10 ميكرولتر تحتوي على ستة ميكرولتر من qPCR Master Mix ، وميكرولترين من الماء المقطر المزدوج ، وميكرولترين من العينة أو المعيار. انقل لوحة qPCR إلى أداة PCR في الوقت الفعلي مبرمجة كما هو موضح في بروتوكول النص وقم بإجراء التشغيل. بعد القياس الكمي ، قم بإنشاء المكتبة المدمجة عن طريق إضافة أحجام متساوية من جميع المكتبات الفردية في أنبوب واحد.

بعد تخفيف وتغيير طبيعة المكتبة المدمجة والتحكم في التسلسل ، قم بتحميل الخليط المركب على خلية تدفق التسلسل. قم بتنظيف خلية التدفق جيدا قبل التحميل للحصول على البصريات المثلى. بعد ذلك ، قم بتحميل خلية التدفق على جهاز التسلسل وقم بإجراء تحليل تسلسل amplicon.

عرض منحنيات الندرة لتطبيع عدد التسلسلات هنا. وتشير هذه المنحنيات إلى أن المقارنة إلى 2000 تسلسل لكل عينة ينبغي أن تكون كافية لالتقاط التنوع الكامل للوحدات التصنيفية التشغيلية المرصودة. بعد الترشيح وتصفية الجودة ، يتم إجراء مخرجات تنوع ألفا وبيتا.

يظهر هنا مؤامرة تحليل إحداثيات المبدأ الذي تم إنشاؤه تلقائيا والتي تصور كيف يختلف تكوين ميكروبيوم القراد بناء على العلاج. علاوة على ذلك ، يتم إنشاء تصور الميكروبات الموجودة داخل كل عينة ، كما هو موضح هنا على مستوى الشعبة ، تلقائيا لجميع العينات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على تقنية معقمة لتقليل تأثير التلوث الميكروبي الذي يمكن أن يؤثر بشكل حاسم على تفسير بيانات التسلسل.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التلوين النسيجي للإجابة على أسئلة إضافية مثل ، أين توجد الميكروبات المرصودة داخل المتجه؟ بعد تطويرها ، مهدت هذه الطريقة الطريق للباحثين في مجال البيئة الجزيئية لاستكشاف دور التفاعلات الميكروبية داخل الناقل والتحقيق في كيفية تأثير ذلك على انتقال مسببات الأمراض.