التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة الفيروسية ، مثل العوامل المضيفة التي تقيد تكاثر الفيروس المفصلي ، وبالتالي ، أي بروتينات التهرب المناعي المشفرة بالفيروس تتغلب على آليات تقييد المضيف هذه. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للمرء باستخدام مقايسات التلألؤ البسيط والفضاء الفلوري لتحديد الظروف الخلوية التي تسمح للفيروسات المفصلية بالتكاثر في عدوى فاشلة في خلايا حشرات حرشفيات الأجنحة. نظرا لوجود الحد الأدنى من التكرار في الخلفية للفيروسات المفصلية في خلايا حرشفيات الأجنحة ، يصبح من السهل نسبيا على المرء اكتشاف الظروف التي تسمح بتكاثر الفيروس المفصلي.

للبدء ، حافظ على خلايا LD652 في أطباق معالجة بزراعة الأنسجة بطول 10 سم ، وقم بتمرير الخلايا عندما تصل إلى 80٪ من التقاء. وسائط الماصة على طبقة خلية أحادية بشكل متكرر لإزاحة الخلايا ، ثم تخفيف العينة في وسط النمو إلى كثافة تقريبية تبلغ 100 ألف خلية لكل مليلتر. بعد ذلك ، انقل ملليلتر واحد من الثقافة المخففة إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا.

ثم اترك الخلايا تستقر لمدة ساعة واحدة على الأقل. قبل 30 دقيقة من الإصابة ، قم بإذابة سيقان VSV luciferase وفيروس اللقاح على الجليد. بعد ذلك ، قم بتخفيف VSV luciferase مع وبدون فيروس اللقاح في SFM ، بحيث يتم تحقيق MOI 10 و 25 ، على التوالي.

استنشاق وسائط LD652 الناضجة بعناية ، لتجنب إزعاج طبقة أحادية الخلية ، وتلقيح كل بئر ب 0.2 مل من الفيروس. بعد ذلك ، أضف SFM معقما إلى آبار إضافية لتكون بمثابة عناصر تحكم سلبية مصابة بهمية. احتضان الخلايا في اللقاح لمدة ساعتين عند 27 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بإزالة اللقاح عن طريق الشفط واستبدله بملليمتر واحد من وسائط النمو LD652 في كل بئر. بعد ذلك ، اترك العدوى تستمر لمدة 24 إلى 72 ساعة أخرى. أولا ، قم بشفط المادة الطافية بعناية وأضف ملليلترا واحدا من DPBS إلى كل بئر.

باستخدام مكبس حقنة ، اكشط الخلايا إلى DPBS. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وجهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 400 ضعف الجاذبية وأربع درجات مئوية. وفي الوقت نفسه ، قم بتخفيف مخزن تحلل المراسل خمس مرات في الماء المعقم.

بعد الطرد المركزي ، قم بشفط DPBS دون إزعاج الحبيبات. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر من مرة واحدة RLB. بعد ذلك ، احتضان العينة عند سالب 80 درجة مئوية ، متبوعا بذوبان سريع في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بتخزين المحللات عند سالب 80 درجة مئوية لمزيد من التحليل. قم بإذابة المحللات على الثلج والماصة 20 ميكرولترا من المحللة في آبار صفيحة 96 بئرا. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من منطقة فحص لوسيفيراز إلى كل بئر من اللوحة.

على الفور ، قم بقياس شدة الضوء باستخدام مقياس لومينو. في ظل ظروف العدوى الفردية ، تقيد خلايا LD652 تكرار VSV luciferase. وبالتالي ، يتم ملاحظة إشارة لوسيفيراز صغيرة فقط.

ومع ذلك ، تؤدي العدوى المشتركة إلى إشارات لوسيفيراز أعلى بكثير. في ظل ظروف العدوى الفردية ، تقيد خلايا LD652 أيضا تكرار VSV dsRED ، وبالتالي فإن عددا صغيرا فقط من الخلايا يعرض إشارة dsRED. ومع ذلك ، تؤدي العدوى المشتركة بفيروس اللقاح إلى عرض معظم الخلايا لإشارات dsRED بنهاية الدورة الزمنية.

ما يقرب من 2٪ من الخلايا من العدوى الفردية كانت إيجابية dsRED بحلول 65 ساعة بعد الإصابة. في المقابل ، كان ما يقرب من 77٪ من الخلايا المصابة المشتركة إيجابية dsRED في نفس النقطة الزمنية. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين النقاط الزمنية التي سيتم عندها أخذ فحوصات لوسيفيراز أو النقاط الزمنية لتصوير الخلايا الحية من أجل إتاحة الوقت الكافي ل VSV للنسخ المتماثل وإنتاج إشارة يمكن اكتشافها.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الضربة القاضية بوساطة تداخل الحمض النووي الريبي لعوامل المضيف ، من أجل تحديد العوامل المضادة للفيروسات المضيفة المحتملة التي تحد من تكاثر الفيروسات المفصلية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة الفيروسية لتحديد دور بروتينات A51R المشفرة بفيروس الجدري في تعزيز تكاثر فيروس الجدري والتسبب في المرض. لا تنس أن العمل مع فيروسات حقيقية النواة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ومن المهم اتخاذ الاحتياطات المناسبة ، مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.