أسلوب صافي المستندة إلى القالب لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة ثلاثي الأبعاد
أغسطس 5, 2018
هذا البروتوكول وصف أسلوب المستندة إلى القالب صافي لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة ثلاثية الأبعاد مع السلامة الهيكلية مرضية وسلوك الضرب متزامن.
يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة وسهلة تعتمد على العفن لإنشاء أنسجة قلبية ثلاثية الأبعاد ، والتي تستخدم الفيريات كأداة لإنشاء أنسجة القلب الحرة للسقالات. في تجاربنا ، تم عزل ثلاثة أنواع من الخلايا ، والخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان ، والخلايا الليفية القلبية البشرية ، والخلايا البطانية للوريد السري البشري واستخدامها لتوليد تعليق الخلية. مع 70٪ خلايا عضلة القلب ، و 15٪ الخلايا الليفية ، و 15٪ الخلايا البطانية ، في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
ثم نقوم بتوزيع تعليق الخلية في كل بئر من نظام إسقاط معلق منخفض للغاية ، مما سيؤدي إلى تكوين تلقائي لمئات الكرات الكروية المضبوطة بعد ثلاثة أيام. ثم يتم حصاد الكرات الكروية ووضعها في تجويف قالب جديد. ثم يتم الاحتفاظ بالأنسجة في وعاء معقم مع وسيط ، على شاكر في الحاضنة لعدة أيام.
تتم إزالة القالب لاحقا ، مما ينتج عنه رقعة أنسجة خالية من السقالات ذات السلامة الميكانيكية. جهاز الإسقاط المعلق عبارة عن ملحق قابل لإعادة الاستخدام ومنخفض للغاية مع 850 مسامية صغيرة ، يبلغ قطر كل منها 350 ميكرون. القطرة المعلقة متوافقة مع ستة ألواح آبار قياسية.
بعد عمل تعليق الخلية ، نقوم بتوزيع أربعة ملليلتر من تعليق الخلية الذي يحتوي على 10 ملايين خلية ، لكل بئر من نظام الإسقاط المعلق. يتم زراعة الأجهزة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. بعد 72 ساعة لوحظ تكوين تلقائي للكرات الكروية النابضة ، بمتوسط قطر 350 ميكرون.
يتم حصاد الكرويات عن طريق وضع جهاز الإسقاط المعلق في طبق آخر متوسط ، والدوران برفق لتحرير الكرات والسماح لها بالانجراف عبر المسام الموجودة أسفل نظام الإسقاط المعلق. هذا هو الرسم التخطيطي للقالب الجديد لإنشاء أنسجة قلبية ثلاثية الأبعاد وخالية من السقالات. ويشمل حصيرة المناولة وقاعدة التعبئة والقالب الجديد.
يتكون القالب الجديد من قاعدة ، ولوحة مربعة سفلية ، وشبكة سفلية ، و 10 طبقات من الشباك الجانبية المصنوعة من شوكات الفولاذ المقاوم للصدأ الدقيقة. شبكة علوية ، لوحة مربعة علوية ، أنابيب تثبيت ، ودبابيس سدادة. يمكن لنظام Novel Mould إنشاء أحجام مختلفة من الأنسجة ، بما في ذلك اثنين في ملليمترين ، وأربعة × أربعة ملليمترات ، وستة × ستة ملليمترات.
يتم تكديس اللوحة المربعة السفلية السفلية والشبكة السفلية ومحاذاتها باستخدام أعمدة الزاوية. ثم يتم تكديس 10 طبقات من الشباك الجانبية في اتجاهات متناوبة لإنشاء شبكة من الشوكات المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، بمساعدة زوج من الملقط المعقم. ثم يتم شطف قاعدة التعبئة بمحلول عازلة الفوسفات 1X ، أو PBS ، لتقليل التوتر السطحي قبل وضع الكرات في القالب الجديد.
بعد ترطيب تجويف العفن الجديد في نفس الميثان ، يتم وضع الكرات في التجويف المفترض مسبقا بالحجم المطلوب. عند الجلوس ، يتم تصريف الوسط الزائد من خلال القالب الشبكي ، مما يسمح للكرات بملء واتخاذ شكل التجويف المحدد مسبقا. ثم يتم تجميع الشبكة العلوية واللوحة المربعة العلوية على أعمدة الزاوية ويتم تثبيت دبابيس السدادة وأنابيب التثبيت ، لمنع غسل الكرويات.
يتم نقل نظام القالب الجديد المملوء إلى صفيحة من ستة آبار ، مع ستة ملليمترات من الوسط المكمل B-27 ، ثم يتم الاحتفاظ به في الحاضنة على شاكر متأرجح لمدة سبعة إلى عشرة أيام ، عند 30 إلى 40 دورة في الدقيقة. يمكن تغيير مدة الحضانة ، اعتمادا على حجم رقعة القلب. بعد الحضانة ، يتم إخراج النظام وإزالة أنبوب الإمساك والسدادات واللوحة المربعة العلوية والشبكة العلوية.
ثم تنزلق الشبكات الجانبية ذات الطبقات بعناية واحدة تلو الأخرى ، مع الحرص على عدم تعطيل الأنسجة. بعد إزالة جميع الشباك الجانبية ، يتم الحصول على رقعة قلبية سليمة أعلى الشبكة السفلية. لوحظ الضرب المتزامن الوظيفي في غضون 24 ساعة.
هذه الطريقة الجديدة القائمة على القالب هي طريقة فعالة وسهلة لإنشاء أنسجة قلبية خالية من السقالات ثلاثية الأبعاد ، بأقل جهد يدوي. تتكون الأنسجة متعددة الطبقات الناتجة من كرويات منصهرة ذات سلامة هيكلية مرضية وسلوك ضرب متزامن. تقدم هذه الطريقة الجديدة القائمة على القوالب بديلا فعالا من حيث التكلفة وقابلا للتطوير لطرق التصنيع الحيوي الحالية للأنسجة الهندسية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة مبتكرة تعتمد على القالب لإنشاء أنسجة قلبية ثلاثية الأبعاد خالية من الدعامات. تستخدم الطريقة الكريات الكروية لتحقيق سلامة هيكلية مرضية وسلوك ضرب متزامن.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- هندسة الأنسجة القلبية
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- الطب التجديدي
الخلفية
- الأنسجة القلبية ثلاثية الأبعاد ضرورية لدراسة وظيفة القلب.
- الطرق الخالية من الدعامات يمكن أن تعزز تكامل الأنسجة ووظائفها.
- تعتبر الكريات الكروية أداة واعدة لتطوير الأنسجة القلبية.
- يمكن أن يؤدي الجمع بين أنواع مختلفة من الخلايا إلى تحسين خصائص الأنسجة.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لإنشاء أنسجة قلبية خالية من الدعامات.
- التحقيق في استخدام الكريات الكروية في تكوين الأنسجة القلبية.
- لتقييم السلامة الهيكلية ووظيفة الأنسجة المتولدة.
الطرق المستخدمة
- عزل الخلايا القلبية الليفية وخلايا البطانة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المحفزة البشرية.
- إعداد معلق خلوي بنسب محددة من أنواع الخلايا.
- توزيع معلق الخلايا في نظام قطرة معلقة منخفضة الالتصاق.
- حصاد الكريات الكروية وجلوسها في تجويف قالب جديد لصيانة الأنسجة.
النتائج الرئيسية
- تشكيل ناجح لمئات الكريات الكروية المضاربة بعد ثلاثة أيام.
- حافظ على الأنسجة في بيئة معقمة مما أدى إلى أنسجة قلبية قابلة للحياة.
- أظهرت الطريقة سلامة هيكلية مرضية.
- تمت ملاحظة سلوك ضرب متزامن في الأنسجة المتطورة.
الخلاصات
- الطريقة القائمة على القالب فعالة لإنشاء أنسجة قلبية خالية من الدعامات.
- يعزز استخدام الكريات الكروية تطوير الأنسجة القلبية الوظيفية.
- قد يكون لهذه الطريقة آثار في مجال الطب التجديدي والأبحاث القلبية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This scaffold-free cardiac tissue method addresses the need for reproducible, physiologically relevant models in early cardiovascular drug discovery. By generating mature, beating human cardiac tissues from iPSC-derived cells, it enables mechanistic de-risking of cardiotoxicity and efficacy targets. The approach supports predictive confidence in lead identification and preclinical triage through scalable, low-cost tissue fabrication.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a multicellular human cardiac model containing cardiomyocytes, fibroblasts, and endothelial cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing synchronous beating and structural integrity as functional readouts for pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces hundreds of uniform spheroids per run, enabling standardized preparation of tissue-building blocks for downstream assembly.
- Operational Value: The hanging drop system is compatible with standard 6-well plates and allows scalable spheroid generation for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates mature, multilayered cardiac patches with synchronous beating within 7–10 days, supporting disease-relevant functional assessment.
- Operational Value: Offers a scaffold-free, reusable mold system that reduces variability and enhances reproducibility across preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical model development, providing a bridge between spheroid-based screening and functional tissue evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through co-culture of three key cardiac cell types in a physiologically relevant ratio.
- Screening: Enables scalable spheroid production with quantitative outputs (size, beating frequency) for compound effect assessment.
- Analytics: Provides functional readouts including synchronous beating and structural integrity to compare treatment conditions.
- Translational Research: Delivers disease-relevant human cardiac tissue that models multicellular interactions and maturation processes.
- Enterprise Reuse: The mold and hanging drop systems are reusable, positioning the method as a sustainable platform for repeated tissue generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through functional, scaffold-free human cardiac tissue with multicellular composition.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via ultra-low attachment hanging drops and precision-molded tissue casting.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on early human tissue-level efficacy and safety signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, spheroid formation, and tissue handling.
- Depends on ultra-low attachment hanging drop systems and sterile stainless steel mold components.
- Necessitates standardized seeding ratios and incubation conditions for batch-to-batch consistency.
- Adaptation to other tissue types would require optimization of cell ratios and mold geometry.
- Manual spheroid seeding and mold assembly steps may limit throughput without automation integration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:14
Process Flow of Cardiac Tissue Creation by Novel Mold
1:21
Spheroids Creation by Hanging Drop Method
3:26
Seeding Spheroids into the Mold Cavity
5:16
Result: The 3D Cardiac Patch Contains of Stacked Spheroids with Functional Beating after Removing from Novel Mold
5:58
Conclusion
