الإنزيم لوسيفراس الفائق لتقييم بروتيوليسيس PCSK9 حوزتي واحدة--دوران

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكيمياء الحيوية PCSK9 مثل الأدوية أو التغيرات الجينية التي تؤثر على وظيفة التحلل للبروتين في PCSK9. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقراءة سريعة وقابلة للتضخيم لحدث كيميائي حيوي منخفض التردد في جوهره. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو أمراض القلب تصلب الشرايين لأن وظيفة الانحلال البروتيني PCSK9 مطلوبة لتأثيرها النهائي على مستويات الكوليسترول في الدم.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة ل PCSK9 نفسها ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأنظمة الكيميائية الحيوية الأخرى مثل البروتياز الأخرى ذات النشاط المحلل للبروتين المنخفض جوهريا. للبدء ، قم بسحب الوسط من كل خلايا HEK293 T. يغسل باستخدام PBS ، ويعالج بأقل حجم يبلغ 0.5٪ Trypsin-EDTA.

واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق لفصل الخلايا عن القارورة الأصلية. أضف مجلدين من DMEM مكملة بنسبة 10٪ FBS لتعطيل Trypsin-EDTA. ثم قم بإخراج السائل الموجود في القارورة لأعلى ولأسفل عدة مرات ، وقم بإزاحة الخلايا الملتصقة ونقل الخلايا إلى أنبوب معقم.

بعد ذلك ، قم بإزالة كمية صغيرة من الخلايا. قم بصبغة بحجم متساو من Trypan Blue وانقل الخلايا الملطخة إلى شريحة ، واستخدم عداد الخلايا الآلي لحساب الخلايا. الطرد المركزي للأنبوب عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق لاستعادة الخلايا.

بعد ذلك ، قم بشفط الوسط وأعد تكوين الخلايا ووسط الثقافة إلى التركيز المطلوب. باستخدام ماصة متعددة القنوات وحوض معقم ، انقل 100 ميكرومتر من الخلايا في كل بئر إلى صفيحة بئر بيضاء 96. بعد ذلك ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

بعد ذلك ، قم بإعداد صفيحة البلازميدات إلى التركيز المطلوب للتعداء ، بما في ذلك أربعة آبار لكل منها للتحكم الإيجابي البلازميد ، والتحكم السلبي البلازميد ، والمخزن المؤقت الخالي من البلازميد. أولا ، قم بإعداد مزيج رئيسي من كاشف تعداء الدهون المخفف ومزيج رئيسي من كاشف الحمض النووي المسبق للتعقيد. بعد ذلك ، باستخدام ماصة متعددة القنوات وحوض معقم ، قم بنقل 16.8 ميكرولترا من كاشف ما قبل تعقيد الحمض النووي المخفف في كل بئر من صفيحة الآبار العميقة.

بعد ذلك، استخدم الماصة متعددة القنوات لنقل 3.2 ميكرولتر من كل بلازميد من اللوحة الرئيسية إلى كل بئر من لوحة البئر العميقة. بعد ذلك ، استخدم الماصة لإضافة 20 ميكرولترا من خليط كاشف نقل الدهون المخفف إلى كل بئر من اللوحة واخلطها جيدا. قم بتغطية الأطباق واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة لتشكيل مجمعات الحمض النووي الدهني.

بعد ذلك، استخدم الماصة متعددة القنوات لإزالة الوسط برفق من الخلايا التائية 293 في لوحة 96 Well. بعد ذلك ، استبدل الوسيط ب 95 ميكرولتر من DMEM مكملا بنسبة 10٪ FBS. بعد ذلك، استخدم الماصة متعددة القنوات لإضافة 10 ميكرولترات من خليط الإرسال إلى كل بئر مناسب.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. أولا ، قم بإعداد حلول المخزون المطلوبة لصنع كاشف فحص Coelenterazine مزدوج القوة ، بما في ذلك ثلاثة أسكوربات الصوديوم المولي في PBS ، وخمسة كلوريد الصوديوم المولي في الماء المقطر ، و 10 ملليغرام لكل مليلتر من BSA في PBS ، واثنين من المليمولار Coelenterazine في الميثانول المحمض. بعد ذلك ، قم بإعداد ما يكفي من كواشف Coelenterazine لقراءة Luciferase.

مع كاشف منفصل لكل من الخلايا في الوسط. بعد ذلك ، امزج جميع الكواشف المتوقعة ل Coelenterazine. قم بتصفية الخليط من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.

ثم بعد الترشيح ، أضف Coelenterazine. قم بإزالة الخلايا من الحاضنة بعد 24 ساعة من التعدي. بعد ذلك، استخدم الماصة متعددة القنوات لنقل 50 ميكرولترا من الوسط المكيف من كل بئر إلى صفيحة بيضاء جديدة تتكون من 96 بئرا.

استخدم الماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولترا من كاشف Coelenterazine غير المحلل مزدوج القوة إلى اللوحة التي تحتوي على الوسط المكيف فقط. ثم رج الطبق برفق في الظلام لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، كرر هذه الخطوة عن طريق إضافة كاشف Coelenterazine الليتي مزدوج القوة إلى اللوحة التي تحتوي على الخلايا.

بعد الحضانات ، قم بقياس تلألؤ اللوحة المتوسطة فقط واللوحة المحتوية على الخلية في قارئ اللوحات. أخيرا ، تخلص من اللوحات واحفظ الملفات لمزيد من تحليل البيانات. من المهم احتضان كاشف لوسيفيراز مع اللوحة المتوسطة فقط واللوحة المحتوية على الخلية لنفس الفترة الزمنية لأن بيانات هذه الألواح تتم مقارنتها مباشرة.

في هذا البروتوكول ، تم تقييم خصوصية تسلسل الانقسام للبروتياز PCSK9 في مواقع الركيزة P6 إلى P6 Prime بواسطة فحص لوسيفيراز. التغييرات في تسلسل الانقسام في المواضع P6 و P4 إلى P1 Prime لا تتسامح معها بشكل جيد من قبل البروتياز. لكن المواضع P5 و P2 Prime من خلال P6 Prime أكثر مرونة في التغيير.

بالإضافة إلى ذلك ، تظهر النتائج أن تسلسلات الانقسام المثلى هي في الأساس نفس تسلسل النوع البري. تمت مقارنة نشاط الانقسام النسبي لمكتبة من القصاصات الخاطئة الموجودة في العيادة بالبروتياز من النوع البري. من بين 84 قصاصة تم تقييمها ، أظهر أكثر من نصفها تغييرات كبيرة في النشاط مقارنة بالبروتياز من النوع البري ، مما يشير إلى أن التغيرات في نشاط البروتياز لوحظت بشكل متكرر في السكان السريريين.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل قياس التدفق الخلوي أو فحوصات امتصاص الكوليسترول في خلايا الكبد لتقييم التغيرات في قدرة PCSK9 المحللة للبروتين على تأثير PCSK9 على مستقبلات LDL.